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萝莉胖

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[交流] BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题已有6人参与

请问大家，用BSA做考马斯亮蓝标准曲线来测定目的蛋白浓度，如果目的蛋白的分子量和BSA差很多的时候，BSA标准曲线是否能用？还是需要用与目的蛋白差不多的蛋白来做标准曲线？
详细：
1. 我有一目的蛋白，叫细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR），分子量为26kD，其中Arg、Trp、Phe和Tyr这四个残基一共有38个。
背景：
1）细菌视紫红质（简称BR），除了在280nm有吸收峰外，在558nm处也有吸收峰（暗适应态），因为此蛋白内部有一个发色团。
2）BR的浓度计算，一般是用在558nm的摩尔消光系数ε558=53000M-1cm-1来计算。

2. 用摩尔消光系数得到的BR浓度vs用考马斯亮蓝法（BSA标曲）得到的浓度
1）我配制一定浓度的BR溶液，测得OD558=0.396，用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml
2）用BSA制备标曲曲线，步骤如下：
称取2.06mg BSA溶于20ml去离子水，母液浓度为0.103mg/ml，与染料作用10分钟，具体参数和标准曲线见图。
用此标准曲线，测定上述BR溶液浓度，取1ml待测液，与4ml考马斯染液作用10分钟，取3ml测OD595=0.474，计算得到此蛋白浓度为为49.69ug/ml。
用两种方法测定的蛋白浓度相差约四倍。

疑问：1.为什么会有这样的差异，是因为BSA和BR这两种蛋白的分子量和所含的氨基酸成分不同造成的吗，还是因为BR本身在558nm有吸收峰而造成的影响？
2. 我有另一个目的蛋白，和BR一样也是细菌类视紫红质，在550nm有特征吸收峰，测定这个蛋白，我是用BSA还是BR来做标准曲线？

谢谢，如果有不清楚的地方，请回帖问我。

BR光谱扫描.jpg

BSA参数.jpg

BSA标曲.jpg

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我是自己的神

1楼2013-11-08 10:35:20

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引用回帖:

10楼: Originally posted by 小熊笨笨run at 2013-11-12 18:32:36
你好！可以展示下你用BSA标曲测所得的原始数据吗？我现在按你所提供的得到的也不是你所说的数值，是不是你取1ml的待测液也进行了一定的稀释？你想到的蛋白状态是否影响测浓度的准确性，这点我没考虑过，但觉得不是 ...

用此标准曲线，测定上述BR溶液浓度，取1ml待测液，与4ml考马斯染液作用10分钟，取3ml测OD595=0.474。根据BSA标曲公式y=0.048x-0.003，已知y=0.474，x=9.9375ug/ml，因为待测液是1ml，所以乘以5，得浓度为9.9375×5=49.6875，近似49.69ug/ml。以上，我想这个应该没啥问题，我没有算错吧。1ml的待测液没有再进行稀释，就是配的1ml未知浓度的蛋白待测样品。