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任天青

金虫 (小有名气)

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[求助] 凝胶层析蛋白洗不下来

各位大神：

我而今算是遇到了最诡异的事了。我用的是Sephadex G-75，手工分多次装柱（没有装柱器），肉眼看来柱子装的比较均匀。之前用蓝色葡聚糖跑了一下，能跑出来。但不论是我的蛋白样品或者是BSA溶液，核酸蛋白检测仪均检测不到蛋白质存在。

详细情况是这样的：
1）第一次装柱，蓝色葡聚糖ok，将我的蛋白液【注】与蓝色葡聚糖混合后再次上样，结果在几乎和蓝色葡聚糖出来的同时，检测仪发现有大量蛋白正在洗出来了。但一个蛋白峰过后，再也没有检测到有任何蛋白洗出。
2）用缓冲液冲洗柱床过夜，次日，加入~1%床体积的BSA溶液，发现一个蛋白吸收峰都没有了。
【注】：溶解目的蛋白液的缓冲液是柱缓冲液的5×形式，上样前已经10000g离心去除了上样中的沉淀。柱是25× Φ2.5cm的，流速约1ml/min(恒压)。

这个会的人应该是很简单的，但小弟这边还是自己摸索，希望大家给予点指导。不胜感激

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1楼 2013-10-30 23:01:34

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冼亮淀粉酶

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生物大分子降解酶

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引用回帖:

11楼: Originally posted by 任天青 at 2013-11-02 20:43:46
看到冼亮淀粉酶君在小木虫里的关于凝胶层析的回复，膜拜中(http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3059537)。话说1ml样品对于我的柱子来说是差不多1%了。因为我的空柱体积约为196ml，我泡凝胶的时候，准备的胶体 ...

其实我做凝胶过滤的时候，无论是用自己装的还是GE的，都失败了，原因未知。所以我也只能谈点理论的东西。

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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。

12楼2013-11-02 20:53:12

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冼亮淀粉酶

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2013-11-01 19:22:00
任天青(wizardfan代发): 金币+5, 谢谢参与 2013-11-02 10:24:19
任天青: 金币+4, ★有帮助 2013-11-05 10:24:55

如果你的蛋白质样品不是纯品，那么第一次只有一个峰出来，就表示该柱的分离效果为零。第二次没有吸收峰，有可能是因为蛋白质太少达不到检测下限。

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