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民爱桥

铜虫 (小有名气)

[求助] WB结果膜总是黑成一片是怎么回事 已有1人参与

做WB整整有一个月了，结果都不好，主要是条带颜色淡，背景颜色深，有时甚至是整个黑成一片，根本看不到条带的影子，很是恼火。有尝试过换封闭液，增加封闭时间，增加洗膜次数，可结果依旧不好。现在的条件是5%的脱脂奶粉（光明），一抗孵育过夜，洗膜（TBST：Nacl 8.8g,1M PH7.5 Tris HCL 20ml，Tween 20 1ml,蒸馏水定容至1L）5min*5次，二抗孵育1h，请教给位大神，我的问题到底出在哪儿,是操作中还是真的是抗体不行呢？
2013-09-26_12-12-43-LUM-Ex(None-)-Em(1).jpg
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WB结果膜总是黑成一片是怎么回事
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WB结果膜总是黑成一片是怎么回事-1
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1楼 2013-10-23 09:45:20
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wodexinqin

铁杆木虫 (著名写手)

为卿痴狂 傻瓜帮帮主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
民爱桥: 金币+5 2013-10-27 09:06:27
民爱桥: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-01-07 09:26:53
你这种情况，如果是化学发光，不把膜上的多余液体除尽就去发光，是会产生这种背景的，在加发光液之前先用吸水纸把膜表面的多余液体吸干，膜放在平整干净透明的载体上，再去发光试试看。
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其实我对自己也并不十分了解……
16楼2013-10-26 19:37:54
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niushuaiji

金虫 (正式写手)

不放弃的小鸟

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-23 10:39:13
民爱桥: 金币+5, ★有帮助 2013-10-24 16:08:19
用的什么水？换成超纯去离子水试试
赞一下 回复此楼
Tobeornottobe,that'saproblem
2楼2013-10-23 10:19:39
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-23 10:39:26
民爱桥: 金币+5 2013-10-24 16:10:03
背景太深的问题，缩短一抗时间试试。
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3楼2013-10-23 10:19:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 专家考核, 鼓励回帖交流！ 2013-10-24 00:29:33
民爱桥: 金币+10, ★有帮助 2013-10-24 16:09:55
背景太高了，原因与解决方法：
1.封闭不充分。延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）。
2. 一抗浓度过高 。增加一抗稀释倍数。
3.抗体孵育温度过高。4℃孵育。
4.二抗非特异性结合或与封闭剂交叉反应。设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 。
5.一抗或二抗与封闭剂有交叉反应。 在孵育和洗涤液中加入 Tween-20 以减少交叉反应。
6.洗膜不充分。增加洗涤次数。
7.膜不合适。NC 膜比 PVDF 膜背景低。
8.膜干燥。保证充分的反应液，避免出现干膜现象。
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4楼2013-10-23 11:13:01
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