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475502411

铜虫 (著名写手)

MolEPI: 2
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虫号: 933070
注册: 2009-12-25
性别: MM
专业: 认知心理学

[求助] PGEX-4T-1载体表达产物，GST标签的切除

最近做一个蛋白连接到GEX-4T-1上进行表达，但发现该蛋白检测人血清中的抗体的时候，有很高的假阳出现。现在考虑可能是GST标签的原因，因此想切除此标签。我们论坛上的虫友不知道有没有做过相关的，麻烦指导一下
1. 选用凝血酶进行切除，看有人用人凝血酶（sigmaT6884 ），不知道效率如何
2.用GST纯化以后再切，切了以后再过柱子，流穿出来的就是我的样品，但凝血酶怎么除掉
3. 这样的话成本会不会很高

另外，有没有虫友有说明书，可不可以分享一下

不胜感激

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可以朝九晚五，也能浪迹天涯

1楼 2013-10-15 16:10:29

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

应助: 16 (小学生)
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性别: GG
专业: 抗体工程学

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-20 18:22:19

引用回帖:

12楼: Originally posted by 475502411 at 2013-10-18 08:50:46
我的目的蛋白的大小是52KD，thrombin大小是30多。可以吗？求指教...

那就用thrombin不好办了，要不你就用IMPACT Kit试剂盒，IMPACT表达的目的蛋白通过与蛋白自剪接元件intein，连接几丁质结合蛋白域（CBD）形成融合蛋白，通过几丁质柱亲和纯化融合蛋白。在特定的条件下，诱导内含肽的肽键裂解活性，将目标蛋白释放出来，而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质纯化介质上，达到单柱分离纯化蛋白的目的。而且，最终得到目的蛋白上不会残留多余的氨基酸。只是这个系统成本较高。