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wangliually

新虫 (初入文坛)

[求助] DNA提取时有RNA污染

我提取植物的DNA出现严重的RNA污染,这是为什么?我采用的是NY1485-4-2010的CTAB有机法,没有加RNA酶。请问RNA酶是必须加的吗?传统的酚氯仿方法中去除RNA的是哪一步?采用国标的方法如果不加RNA酶的话可否除去RNA污染?
DNA提取时有RNA污染
20131009有机法.JPG
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xl_dut

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wangliually: 金币+5, 有帮助 2013-10-11 21:35:57
加入适量的RNA酶,37℃消化30-45min就好了!
传统的碱裂解法提取DNA时也需要加入一定量的RNase的,虽然碱性条件下RNA会发生自动降解,但细胞内的RNA丰度较高,还是需要加入一定量的RNase的。试剂盒提供的方法一般是在溶液I中加入少量RNase,可以取得较好的去除RNA效果,也可以在提取的最后一步加入RNase。
一日之计在于昨天!
2楼2013-10-11 12:22:35
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不加RNase的话样品里当然有RNA。一般是加在破碎前的缓冲液里。如果前期步骤中有用到蛋白酶K,可以在酚氯仿抽提后加。
4楼2013-10-11 14:45:34
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普通回帖

淘淘279

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
看你的情况应该加Rna酶
传统的酚氯仿方法中去除RNA一般在前三个溶液里加入RNA酶。
我们一般在溶液一里面加入RNA酶。
你能做的永远不止这些!
3楼2013-10-11 13:38:28
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wangliually

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xl_dut at 2013-10-11 12:22:35
加入适量的RNA酶,37℃消化30-45min就好了!
传统的碱裂解法提取DNA时也需要加入一定量的RNase的,虽然碱性条件下RNA会发生自动降解,但细胞内的RNA丰度较高,还是需要加入一定量的RNase的。试剂盒提供的方法一般是 ...

那点样孔里亮是怎么回事呢?是蛋白质污染吗?
5楼2013-10-11 21:37:06
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wangliually

新虫 (初入文坛)

还有,点样孔为什么会有亮带?是蛋白质污染吗?如果是的话,我在接下来的操作中应该怎样改进呢?
6楼2013-10-11 21:38:47
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wangliually

新虫 (初入文坛)

还有,点样孔为什么会有亮带?是蛋白质污染吗?如果是的话,我在接下来的操作中应该怎样改进呢?
7楼2013-10-11 21:39:42
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xl_dut

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by wangliually at 2013-10-11 21:37:06
那点样孔里亮是怎么回事呢?是蛋白质污染吗?...

应该是大片段的基因组DNA,楼主跑胶的时间太短了,Marker都没跑开,建议用RNase消化以后重新跑胶!
一日之计在于昨天!
8楼2013-10-12 07:41:56
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wangliually

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by xl_dut at 2013-10-12 07:41:56
应该是大片段的基因组DNA,楼主跑胶的时间太短了,Marker都没跑开,建议用RNase消化以后重新跑胶!...

已经跑到底了,时间再长的话,就跑飞了,怎么办?
9楼2013-10-12 09:04:01
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xl_dut

木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by wangliually at 2013-10-12 09:04:01
已经跑到底了,时间再长的话,就跑飞了,怎么办?...

敢问楼主用的是什么Marker,Marker都没跑开基因组DNA是不会跑出去的。另外,跑在最前端的是小片段的RNA及寡核苷酸,不用担心。而且有溴酚蓝指示剂,大概等到指示剂跑到1/4~3/4处即可。
一日之计在于昨天!
10楼2013-10-12 11:04:42
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