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yaqiu

新虫 (初入文坛)

[求助] 固定液的种类和应用

请问大虾，固定液都有哪些，各自的优缺点是什么。如果要利用切片技术来开展免疫蛋白方面的研究是需要何种固定液，需要透明么？
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1楼2013-10-09 11:47:27
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sayaya

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
免疫组化研究的话，推荐4%多聚甲醛固定液。石蜡切片的话，透明是必须的。
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2楼2013-10-09 13:20:07
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COCO_Xiao澜

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1．单一固定液的性质和用途
（1）乙醇（C2H5OH）（ethylalcohol） ：又名酒精，可沉淀白蛋白、球蛋白、核 蛋白， 后者易溶于水， 所以经酒精固定的标本对细胞核染色不良。 酒精可溶解脂肪、 类脂体， 所以不能用酒精固定脂肪。酒精可沉淀肝糖，但仍可溶解于水，因此肝糖经酒精固定后不能 在低于 70％酒精中保存。单独固定使用酒精的浓度应为 95—100％。无水酒精渗透力较差， 并且能使组织收缩，在与醋酸、氯仿混合使用时，可增强它们的穿透力。酒精除固定作用外，还具有硬化和脱 水的作用，固定后的组织可保存于 70％酒精中，所以酒精在制片过程中用途很大。无水乙 醇容易挥发，又容易吸收空气中的水分，所以瓶盖必须塞紧，为了吸去其中水分，最好在无 水乙醇瓶内放入少量无水硫酸铜粉末。酒精是一种还原剂，不能与重铬酸钾、锇酸等氧化剂 混合使用。
（2）甲醛（HCHO）（formeldehyde）：是一种气体，溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林，一般使用浓度为 10％福尔马林（formalin）液，其配法是取市售的甲醛液 10ml 与 90ml 蒸馏水混合即可，实际上其含量只有 4％甲醛。这样的配法已成为一般实验室常用 的惯例。
     甲醛不能沉淀白蛋白及核蛋白，但能与蛋白质化合。它是一种应用广泛，使用 简单的固定液，具有穿透力强、固定均匀、组织收缩小、硬度适当，适用于一般器官组织的 固定及保存。尤其对脂肪、神经组织固定效果较好。更适于病理组织的制片及大体积标本的 保存，一般组织需固定 24 小时以上，固定后的组织可移入 50％酒精中逐步脱水。
      甲醛是一种强还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合，因极易被 氧化为甲酸。在配混合固定液时，如海利氏液等需临用前再加入，24 小时后失效。
      甲醛由于长期贮存，特别是低温气候，容易产生多聚甲醛，即溶液中的白色沉 淀，在高温下又成为甲醛。不纯的甲醛易产生甲酸，使溶液变为酸性，影响核的染色。所以 在备用的福尔马林中加入小量的醋酸钙、碳酸镁或大理石作为中和剂。可用下法配制 10％ 中性甲醛溶液， pH 为 7.0 左右：
40％甲醛 100ml
蒸馏水 900ml
磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O） 4.0g
磷酸氢二钠（Na2HPO4） 6.5g
甲醛醋酸钙溶液：
40％甲醛 10ml
醋酸钙 2g
蒸馏水 加至 100ml.
（3）醋酸（CH3COOH） （aceticacid） 纯醋酸在低温时结成冰状故又名冰醋酸，约在 17℃时融化，能和水及乙醇混合。使用浓度为 0.3—5％，它能很好地沉淀核蛋白，对 染色质的固定效果很好。 醋酸对染色体的保存能接近生活状态， 因此在固定染色体的固定液 中几乎都含醋酸。醋酸的穿透力很强。它能使组织膨胀，常与其他药剂配合使用，起抑制其他固定剂对组织收缩的作用。
      醋酸破坏线粒体和高尔基体， 所以在线粒体和高尔基体制片及固定液中都不用 醋酸。
（4）苦味酸（C6H2（NO2）3OH）（picricacid） ：是一种强酸，呈黄色结晶，  溶于水、乙醇、苯和二甲苯。干燥时能自燃，爆炸，所以需湿性保存。一般配成饱和水溶液备用（100ml 蒸馏水加 1.2g 苦味酸）。
     苦味酸能沉淀蛋白质，对胞质固定较好。苦味酸的穿透力很慢，能使组织强烈 收缩，一般都与醋酸等药剂配合使用。苦味酸固定的组织会出现黄色，可在低度酒精中加入 少量碳酸锂饱和水溶液，洗去黄色。如遗留少许黄色在组织中，对染色无影响。
（5）重铬酸钾（K2CrO7） （potassium dichromate） ：呈橙红色结晶，可溶于水，有毒，是强氧化剂，不应和乙醇混合。 它穿透力强，能使蛋白质变为不溶性，能保持细胞质的结构与生活状态相仿，并用于线粒体 和高尔基复合器的固定，但需与甲醛、氯化汞等混合使用，是细胞学良好的固定剂。重铬酸 钾固定的组织需经流水冲洗 12—24 小时。
（6）铬酸（H2CrO4） （chromicacid） ：为强氧化剂，是一种弱酸，呈红色或浅 褐色结晶，极易潮解，所以最好配成 1％的水溶液保存。它是强烈的沉淀剂，不单独使用。 硬化程度中等。固定肝糖 的效果优良， 它使肝糖不溶于水。 在固定线粒体和高尔基复合器的固定液中都含有 铬酸成分。 铬酸穿透力较慢，不使组织收缩。固定后的组织需经流水冲洗 12 小时以上， 洗去铬酸，否则会发生沉淀，影响染色。
（7）氯化汞（HgCl2） （mer cury bichloride） ：又称升汞，呈白色针状结晶，能升华，是一种极毒的药品，对粘膜有 腐蚀作用，使用时需特别当心。
     氯化汞能沉淀一切蛋白质，使蛋白质变性不溶于水，对一般染色效果很好，对 固定线粒体和高尔基体的效果也很好。 氯化汞穿透力较弱，收缩力较大，所以一般与醋酸、甲醛等混合使用。经氯化 汞固定的组织会产生氯化亚汞沉淀， 所以组织或切片需用 0.5％碘酒处理 3—5 分钟， 除去沉 淀物，然后用 2％硫代硫酸钠水溶液去碘处理 1—2 分钟。
（8）四氧化锇（OsO4） （osmiuln tatroxide） ：又名锇酸（osmicacid） 。是一种淡黄色结晶体，为强氧化剂，不可与酒 精、甲醛混合，在配制使用过程中瓶皿需特别洁净，固定浓度为 1—2％水溶液。需用棕色 瓶贮存于 4℃冰箱内。
     锇酸是固定脂肪的最好固定剂。穿透速度很慢，能均匀固定蛋白质，能保持细 胞生活时形态，不引起细胞收缩，对细胞质的保存较好，特别适用于线粒体、高尔基复合器 的固定。固定后的透明处理，用苯为透明剂可得良好的切片效果。 锇酸价格极贵，毒性高，蒸气易损伤眼睛及粘膜，使用时应加小心。 锇酸固定的组织切片，不易被苏木精着色，需经过漂白处理。

Lacour 漂白液的配制：
20％H2O2 10ml
80％酒精 30ml
将切片置此液中漂白 4—12 小时，移入 80％酒精、70％酒精、50％酒精中各 2 分钟，蒸馏水充分洗涤后，再进行染色。
     以上简单的固定液各有优缺点，如无水酒精可固定肝糖，但不能固定脂肪，因 脂肪易溶于酒精。 而锇酸能固定脂肪， 氯化汞对蛋白质固定较好， 冰醋酸可以固定核蛋白等， 它们只是对细胞的某些成分固定较好，而不能将所有成分都保存下来。如果互相配合使用， 则能取长补短，得到较好的固定效果，只有了解药品的性质，才能清楚各固定液的性能。下 面介绍几种常用的混合固定剂。

2．混合固定液的配制和性能
（1）包音氏（Bouin’s）固定液 ）
苦味酸饱和水溶液 75ml
甲醛（40％） 25ml
冰醋酸 5ml
本液在使用前配制。 包音氏液为常用的良好固定剂， 适用于无脊椎动物， 组织学、 胚胎学均可应用。 渗透力迅速，固定均匀，组织收缩少。小块组织固定 2—12 小时，一般组织固定 12—24 小 时，固定后用 50％酒精洗涤数次。 此液固定的组织适于苏木精、伊红等染色。用马瑞氏三色染色，能得艳丽的图 像。

（2）任克氏（Zenker's）固定液 ）
重铬酸钾 2.5g
氯化汞 6g
蒸馏水 100ml

冰醋酸 5ml
配制时将重铬酸钾、氯化汞溶于加温的蒸馏水，冰醋酸临用前加入。此固定液 适用于细胞学、组织学的研究工作。固定时间一般需 12—24 小时。固定后要用流水冲洗 12 小时，用碘去汞。此液固定的组织适于一般染色，细胞核、细胞质染色较为清晰。

（3）海利氏（Helly's）液
重铬酸钾 2.5g
氯化汞 6g
蒸馏水 100ml
40％甲醛液 5ml
此固定液是将任克氏配方中的冰醋酸换成甲醛液， 甲醛也在用前加入， 因在加 入甲醛 24 小时后即生成沉淀而失效。固定时间 12—24 小时。海利氏液为骨髓、脾、肝等造 血器官的较好固定剂。此液亦可保存线粒体，染色前需用碘去汞。

（4）苏萨氏（Susa's）[海登哈音氏（Heidenhain's）]  液：
氯化汞 4.5g
氯化钠 0.5g
40 ％甲醛液 20ml
三氯醋酸 2g
冰醋酸 4ml
蒸馏水 80ml
将 4.5g 氯化汞和 0.5g 氯化钠溶于 80ml 蒸馏水中保存。临用前取此液 20ml， 加入三氯醋酸 0.5g，40％甲醛 5ml，冰醋酸 1ml，混合使用。
此液含有三氯醋酸和氯化钠，对较硬的组织有软化作用，如皮肤、蛔虫卵、昆 虫幼虫等角质层较厚的组织，食道、胃均能适用。它具有渗透快、收缩小的优点。小块组织 固定 3—5 小时；大块组织，如皮肤固定 12—24 小时。固定后可直接入 95％酒精洗涤，勿 入水或低度酒精，否则易使胶原纤维膨胀。切片在染色前，用碘去汞。

（5）卡诺氏（Carnoy's）液
纯酒精 60ml
氯仿 30ml
冰醋酸 10ml
此液穿透力强，对核固定优良，是细胞学制片常用的固定液。酒精能固定胞浆 及沉淀肝糖，冰醋酸能固定染色质并防止酒精过度硬化和收缩，氯仿可增加渗透力。小白鼠 的睾丸和马蛔虫的子宫固定需 30—50 分钟，稍大一些的淋巴结、胸腺等组织，可固定 1—2 小时。时间太长易使组织过度硬化，不利于切片。固定后直接入 95％酒精洗涤，然后脱水、 透明、包埋。

（6）酒精、甲醛（简称 A．F）液
95％酒精 90ml
40％甲醛 10ml
如需要可加入 0.5g 的醋酸钙使其呈中性。此液有固定兼脱水的作用，用于病 理快速诊断的制片，也适于肥大细胞的固定。2—3mm 厚的病理组织在 50℃固定 40 分钟， 一般室温固定 12—20 小时，固定后可直接入 95％酒精脱水。
    固定液的种类很多， 用时可查阅制片方面的书籍。 首先要根据实验目的， 选用固定液。 但应用时必须首先了解各种混合固定液中的组成成分能否预先混合， 固定后是 否需要洗涤，然后再开始配制固定液。
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3楼2013-10-10 18:09:47
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