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weishen2银虫 (小有名气)
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重组质粒转化，菌液pcr检测两个菌种，一个全是阳性，一个全没扩出目的条带
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两个菌种属于同一个种属，酶切用的是相同的酶ndeⅠ和xhoⅠ，载体是pet28b 连接目的基因与质粒mol比一个是6：1（127），一个是9：1（137）。4度连接过夜 我用菌液PCR，用的是TAKARA的premix Taq。反应体系是2x premix Taq 10ul，菌液1ul，上下引物各0.5 ul，dd水加到20 ul。 PCR条件：预变性94℃5min， 94℃ 30s， 52℃ 30s， 72℃ 2 min。25个循环。72℃延伸10 min。 电泳结果127全有条带，且均为目的条带。137无结果，基因组pcr用相同的引物是有条带的。第1次没组挑了6个菌落，第2次127挑了5个，137挑了20个，结果还是127全有，137全无条带。 请各位大神指点迷津，问题到底出在哪。 |
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