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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助——荧光定量程序设计问题
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学术问题

银虫 (小有名气)

[求助] 求助——荧光定量程序设计问题

在荧光程序设计上 一般说明书上的程序是 95 30s , 95  5s , 60  30s , 39个循环，95  10s ,65  5s , 95  5s 。  其中的60度 退火这一步 可以改成54,55 等其他温度吗？？因为我用不同PCR扩的时候，在54度才有条带，到了60度就什么都没有了，用60度做荧光定量我觉得可定做不出来啊。。（我用60度跑过程序，CT值差不多在35个循环以后，那就不可信了啊）    求大神指点。。。。。急急

[ Last edited by 1949stone on 2013-9-22 at 12:02 ]
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微生物小硕
1楼 2013-09-22 11:32:49
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hl16010921

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 学术问题 at 2013-09-22 15:52:03
上面有一点说错了  我是做的普通PCR （不是不同PCR），在54度有条带，60度就没有了。 也就是说我可以把荧光定量的程序中60度 改成 54度是吧？？...

由于荧光定量是两步法，普通PCR是三步法，单单把60度改为54度是不行的，你必须添加延伸这一步（Taq在54度的性能不可知）。就是如wangcheng2650，将荧光PCR的条件全改为PCR的条件。
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7楼2013-09-22 21:20:32
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wangcheng2650

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
学术问题(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-22 12:12:03
绝对可以！弄清楚原理撒！
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日子是混出来的！
2楼2013-09-22 11:59:18
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hl16010921

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-23 08:53:52
60度是退火加延伸。一般两步法把这两步合并了，要改动的话建议改为三步法.60度不是最佳延伸温度，低于60度taq的延伸速度更慢，所以退火温度调低时要加延伸步骤，并调整延伸时间。
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3楼2013-09-22 13:41:24
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学术问题

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hl16010921 at 2013-09-22 13:41:24
60度是退火加延伸。一般两步法把这两步合并了，要改动的话建议改为三步法.60度不是最佳延伸温度，低于60度taq的延伸速度更慢，所以退火温度调低时要加延伸步骤，并调整延伸时间。

上面有一点说错了  我是做的普通PCR （不是不同PCR），在54度有条带，60度就没有了。 也就是说我可以把荧光定量的程序中60度 改成 54度是吧？？
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微生物小硕
4楼2013-09-22 15:52:03
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