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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)

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[求助] 酵母表达

有木有人做酵母表达的啊，本人初接触，好多疑问啊

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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单

1楼 2013-09-19 15:52:15

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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

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【答案】应助回帖

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静安jingan: 金币+20, ★★★很有帮助, 所有的流程都说到了，目前就是要就每一步细化了解过程 2013-09-20 15:02:12

酵母培养基有两种：固体和液体，固体的用来活化菌株或者筛选阳性克隆，液体培养基使得活化后的酵母大量繁殖，进而表达目的蛋白。还有筛选的时候要根据表达质粒的抗性添加相应的抗生素。一般的程序是这样子的：根据目的基因选择质粒和宿主，质粒构建（含有目的基因、酶切位点、分泌信号（可选）、抗性基因和标签），质粒转化进大肠杆菌，质粒提取，宿主感受态的制备，转化进选好的宿主酵母（质粒分单拷贝和多拷贝，单拷贝需要线性化，多拷贝在转化时不用酶切），重组子筛选，酵母基因组提取，PCR鉴定阳性克隆，小试表达目的蛋白，目的蛋白鉴定（SDS-PAGE和WB），表达条件优化（摇瓶小试的优化因素可以选择比较重要的几种：如温度，pH，诱导底物浓度、诱导时间（诱导开始时间和时续时间，补料方式一般为间歇性补料）），发酵罐发酵获得大量目的蛋白，蛋白纯化与鉴定，活性测定。