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劳龙宝

新虫 (小有名气)

[求助] 求提取水稻基因组的经验

最近在提取水稻的基因组，但是老是感觉提取的不好（我用RNAase处理了，RNA是没有了，但是就是感觉提取的不怎么好！），因为要做甲基化，对基因组的纯度要求比较高！请问谁可以给我一些建议，最好做是自己提取了比较好的植物基因组，给点经验！本人将不胜感激！
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1楼2013-09-16 10:48:59
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文库构建

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

百博明创实验室以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。
1. 从植物组织提取基因组DNA
　　一、材料
　　水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。
　　二、设备
　　移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。
　　三、试剂
　　1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
　　2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。
　　3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
　　4、 RnaseA母液：配方见第一章。
　　5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
　　四、操作步骤：
　　（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取
　　1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。
　　2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。
　　3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
　　4. 室温下5000rpm离心5分钟。
　　5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
　　6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
　　7. 如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟, 再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
　　8. 将DNA溶液3000rpm离心5分钟, 上清液倒入干净的5ml离心管。
　　9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
　　10. 加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
　　11. 用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
　　12. 将DNA重溶解于1ml TE, -20贮存。
　　13. 取2μl DNA样品在0.7% Agarose胶上电泳, 检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA含量及质量。
　　[注意] 5g样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR等分析之用。
　　（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组DNA
　　1. 取3-5克嫩叶, 液氮磨成粉状。
　　2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。
　　3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。
　　4. 同本节（一）中步骤3-13操作。

信息来源：BAC文库构建筛选专家
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2楼2013-10-16 10:12:34
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劳龙宝

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 文库构建 at 2013-10-16 10:12:34
百博明创实验室以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。
1. 从植物组织提取基因组DNA
　　一、材料
　　水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果） ...

不知道你说的提取水稻的方法，提取的基因组的纯度有多高？
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3楼2013-10-26 22:05:35
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文库构建

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 劳龙宝 at 2013-10-26 22:05:35
不知道你说的提取水稻的方法，提取的基因组的纯度有多高？...

毫无疑问，优质的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的。研究者需要查阅文献，通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法，在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解，同时也要尽量保证DNA的纯度。

二、处理基因组DNA

    根据研究目的，研究者需要选择合适的载体。不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求，研究者必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库。
    构建黏粒基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段，随后使用百博明创的胶回收试剂盒回收DNA。构建BAC基因组DNA文库，研究者需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoR I、BamH I或者Hind III）来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb），随后透析回收DNA。

需要注意：

（1）电泳时，要选用合适的DNA Ladder，以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA。用百博明创试剂盒构建黏粒文库时，就可以直接采用文库试剂盒内的Control Insert DNA来做marker，既方便又准确。

（2）电泳以后，应该避免用紫外光照射目标DNA，紫外光照射DNA会显著降低克隆效率。解决方法：把marker所在的部分凝胶切下，在紫外灯下做好记号，然后以此为参考定位所需的片段。

（3）回收DNA的时候，应该要避免过度离心，以防止DNA被剪切，降低文库质量。

来源:http://blog.sina.com.cn/s/blog_e4e0c7460101de44.html
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4楼2013-10-31 11:02:01
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