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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助从动物体提取某种特定蛋白的方法
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冰凝草

木虫 (小有名气)

[求助] 求助从动物体提取某种特定蛋白的方法

最近老板让我从动物体内提取某种蛋白，我说用活体采样，然后粉碎组织后再用层析或者饱和硫酸铵析出的方法提取总蛋白。但是后续不知道该怎么做。而且老板说我之前的方法也不对。跪求前辈们赐教怎么做这个实验呢，有没有相关的文献可以推荐，不甚感激
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1楼 2013-09-15 16:53:25
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
冰凝草: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-10-03 13:16:36
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冰凝草 at 2013-09-19 17:06:16
你好，能具体说下分子量大小和等电点以及那个硫酸铵分级的选择么，还有如果我想保持那个蛋白的活性，是不是用高盐浓度不大好呢。谢谢...

分子量大小，可以通过查阅以前报道的相关文献获得，或者在NCBI数据库中查到其氨基酸序列，进行换算；等电点也可以通过NCBI数据库中根据目的蛋白氨基酸序列的预测获得，但是不是很准确，准确的方法是利用等点聚焦或者双向电泳分析。硫酸铵沉淀的话，你可以先从20%开始，每隔10个饱和度，来分级进行沉淀，将所得沉淀重新溶解，进行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白在那个范围内沉淀量比较多、杂蛋白较少，来确定最佳的硫酸铵饱和度。一般情况下，硫酸铵不会影响蛋白的活性，很多酶的纯化都可以用这个方法。你可以先试试硫酸铵沉淀，如果确实会导致蛋白变性的话，在采取其他措施吧
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11楼2013-09-25 11:34:34
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同东中郎将

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-17 14:47:18
冰凝草: 金币+2, ★有帮助 2013-09-18 09:20:56
提取样品上清，硫酸铵沉淀，再复溶蛋白，过个疏水柱。
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曾子曰：“士不可以不弘毅，任重而道远。仁以为己任，不亦重乎？死而后已，不亦远乎？”
2楼2013-09-17 14:43:02
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
冰凝草: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-18 09:21:07
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-20 00:22:29
1、查文献，确定蛋白分子量大小、等电点等性质；2、取活体组织，组织捣碎，离心取上清；3、将上清蛋白粗提液进行分级硫酸铵沉淀，确定目的蛋白沉淀的硫酸铵饱和度；3、进行离子交换层析、或者疏水层析，改变层析条件，分析目的蛋白纯度；如果目的蛋白与杂蛋白差别比较大，可以过分子筛凝胶柱。
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3楼2013-09-17 15:25:04
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冰凝草

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shenhaiwang at 2013-09-17 15:25:04
1、查文献，确定蛋白分子量大小、等电点等性质；2、取活体组织，组织捣碎，离心取上清；3、将上清蛋白粗提液进行分级硫酸铵沉淀，确定目的蛋白沉淀的硫酸铵饱和度；3、进行离子交换层析、或者疏水层析，改变层析条件 ...

你好，能具体说下分子量大小和等电点以及那个硫酸铵分级的选择么，还有如果我想保持那个蛋白的活性，是不是用高盐浓度不大好呢。谢谢
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4楼2013-09-19 17:06:16
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