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下雨没有伞

银虫 (小有名气)

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专业: 临床分子生物学检验

[求助] 关天T载体中蓝白斑的问题

本人最近做T载体实验，做了几次都没有成功，现和各位大侠交流求教。
最近一次的实验困扰:
细菌复苏后分别铺菌和摇菌----铺菌出现白斑和蓝斑，白斑大于５０%
　　　　　　　　　　　　----摇菌菌液也变浑浊了。
下一步：挑白斑划线----划了三个平板，均无细菌生长
分析：挑白斑少了。白斑太小
下一步：从冰箱取出再培养了４小时（蓝白斑平板）
挑白斑划线----一次取二到５个白斑划一个平板，共计划三个平板
结果还是无细菌生长，有一个全是蓝斑
分析：挑菌时有可能挑到蓝斑，对摇菌试管进行细菌扩增。
下一步：对摇菌试管取10ul加2mlLB+2ulAMP进行再摇菌扩增
下一步：对摇菌试管和扩增的试管各取100ul用煮沸法用目的片段的引物
PCR进行验证，电泳加目的DNA作阳性对照和Maker,结果有和阳性对照一样
的条带。
下一步：对扩增的试管进行铺菌----分别10^3,2*10^3,4*10^3的稀释倍数
三个平板，结果三个平板均是蓝斑，无白斑。
困扰的问题：
１　第一次有蓝白斑，为何划线分不出白斑？摇菌培养过，液体清亮。
２　验证有目的DNA片段的存在，后续铺菌中为何全是蓝斑？
我的分析：
１白斑可能是其它DNA片段污染---但是即使污染，划线也应该有白斑出现呀
----有没有不含DNA片段的白斑呢？----按蓝白斑筛选的原理是不可能的呀
２验证细菌中有目的DNA片段的存在，铺菌全是蓝斑，可能目的片段的细菌
含量太少，没有出现，----但是三个平板都没有白斑，可能性太小了
３LB平板的配制有问题，我只想到出现了蓝斑那么X-GAL和IPTG应该没有问题，
　AMP是否有影响还不清楚。
请教各位有经验的朋友们帮我分析一下呀，我快被骂死了，做了这么久没有做出来

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