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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pet-32a质粒提取量低的原因
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匿名

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1楼 2013-09-02 22:00:45
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sxxuan

金虫 (著名写手)
pET2832是表达载体，算是低拷贝的质粒，所以提取的时候菌浓度要相应地增加，特别有些质粒还是在BL21里面，质粒会更加地不好提。
我一般是把表达载体转化到克隆宿主中，提取的时候多用一倍的菌液，但是还是分开裂解，到离心完之后把上清合并到同一个纯化柱中继续纯化。要是菌液量加大，但裂解液还是一样的话，可能会出现裂解不完全，毕竟裂解液用量是针对菌，而不是菌里面的质粒拷贝数
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zq191236086
你的日子如何，你的力量也必如何！
5楼2013-09-05 11:59:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2013-09-03 06:17:21
zq191236086: 金币+5, ★有帮助 2013-09-03 12:09:55
T载体是高用于克隆的拷贝质粒，pET32a是用来表达蛋白的，拷贝数低。一般多收点菌裂解就可以了。
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2楼2013-09-03 00:18:35
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析 2013-09-04 06:17:01
silicare: BioEPI+1 2013-09-04 08:26:01
zq191236086: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-04 14:19:40
如果你菌液浓度达到0.6以上，并取1 ml进行提取，如果提取过程中没有损失的话，你的载体的copy数存在下降。可以考虑复壮一下。在高浓度Amp平板上进行划线，然后挑取最快长出菌落的单克隆！Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
3楼2013-09-03 23:11:02
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514278815

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
T载体本身就可大量复制的，表达载体拷贝较少；但是依然可以提取到大量质粒的。你用的那种菌株？我们实验用的TG1，过夜培养提的质粒浓度很高；用试剂盒精抽，双酶切1-2ul即可。
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4楼2013-09-04 17:22:24
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