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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 农林 » 植保 » 验证烟粉虱生物型
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wanghf_6134

新虫 (初入文坛)

[求助] 验证烟粉虱生物型

前段时间，试着提取了一下单头烟粉虱的DNA，总是不出来。师姐说是量太少了的缘故，但也有人能提出来。
我的步骤是这样的：
1、把烟粉虱置于滴有20μlDNA裂解液的封口膜上，用0.2mlPCR管底部研磨
2、将匀浆液吸入1.5ml的离心管中，加入1μl的蛋白酶K，混匀，置于60℃水浴3h，中途追加1μl的蛋白酶K
3、每管加入178μl的dd水，100℃水浴5min
4、取100μl提取液，加入两倍体积的预冷无水乙醇，-20℃2h
5、12000r/min离心20min。DNA沉淀室温晾干
6、每管加20μl的dd水，溶解后放于4℃保存待用
然后是做PCR扩增，电泳。因为电泳上除了marker，没有其他任何结果。怀疑应该是DNA没有提出来，应该不是PCR和电泳的问题吧。。。

[ Last edited by wanghf_6134 on 2013-8-26 at 15:40 ]
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1楼 2013-08-26 15:11:55
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乃容斋

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wanghf_6134: 金币+1 2013-09-16 20:38:49
我以前提过，不过不是用单头的，大概30头左右就可以，用1.5ml离心管液氮冷冻研磨后用l提取。效果挺不错的。
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2楼2013-08-28 16:27:42
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837957358

木虫 (正式写手)

罚

【答案】应助回帖

★ ★
wanghf_6134: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-08 10:10:40
引用回帖:
2楼: Originally posted by 乃容斋 at 2013-08-28 16:27:42
我以前提过，不过不是用单头的，大概30头左右就可以，用1.5ml离心管液氮冷冻研磨后用l提取。效果挺不错的。

先用5ul的蛋白酶磨，然后加20ul的DNA裂解液，45度水浴40min,中途混匀3-4次，然后98度灭活5min,然后直接进行PCR。
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3楼2013-08-29 18:51:29
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wanghf_6134

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 837957358 at 2013-08-29 18:51:29
先用5ul的蛋白酶磨，然后加20ul的DNA裂解液，45度水浴40min,中途混匀3-4次，然后98度灭活5min,然后直接进行PCR。...

是单头的量吗？
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4楼2013-09-03 13:53:21
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837957358

木虫 (正式写手)

罚
引用回帖:
4楼: Originally posted by wanghf_6134 at 2013-09-03 13:53:21
是单头的量吗？...

是的，我们这就是这样做的。你还可以PCR后在进行酶切，在跑电泳进行检测，
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5楼2013-09-03 18:53:50
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wanghf_6134

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 837957358 at 2013-09-03 18:53:50
是的，我们这就是这样做的。你还可以PCR后在进行酶切，在跑电泳进行检测，...

后面不用离心取沉淀，再溶解吗？还有这个裂解液，配方是什么啊
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6楼2013-09-04 10:53:59
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837957358

木虫 (正式写手)

罚

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by wanghf_6134 at 2013-09-04 10:53:59
后面不用离心取沉淀，再溶解吗？还有这个裂解液，配方是什么啊...

不用了，直接加热后灭活蛋白酶后，可以直接进行PCR扩增。
裂解液配方：50mm Tris-Hcl ph=8,    20mm Nacl     0.45%NP40  0.45%Tween20 ,      0.2%Gelatin
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7楼2013-09-04 14:55:03
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837957358

木虫 (正式写手)

罚

【答案】应助回帖

★ ★
wanghf_6134: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-08 10:10:18
引用回帖:
6楼: Originally posted by wanghf_6134 at 2013-09-04 10:53:59
后面不用离心取沉淀，再溶解吗？还有这个裂解液，配方是什么啊...

不用了，直接加热后灭活蛋白酶后，可以直接进行PCR扩增。
裂解液配方：50mm Tris-Hcl ph=8,    20mm Nacl     0.45%NP40  0.45%Tween20 ,      0.2%Gelatin
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8楼2013-09-04 14:55:10
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wanghf_6134

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 837957358 at 2013-09-04 14:55:10
不用了，直接加热后灭活蛋白酶后，可以直接进行PCR扩增。
裂解液配方：50mm Tris-Hcl ph=8,    20mm Nacl     0.45%NP40  0.45%Tween20 ,      0.2%Gelatin...

用的是水浴以后直接的液体吗？
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9楼2013-09-05 21:34:27
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jkamm

金虫 (正式写手)
我以前弄过，没跑出来，最终是引物问题，我还用乙醇沉淀。。多步提取，能提出来的。
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10楼2013-12-03 23:13:34
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