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shucaiyuanyi银虫 (小有名气)
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[求助]
求助菌落PCR的技术流程
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求助菌落PCR的技术流程 查了好多资料,都没有详细的技术流程,希望各位帮下忙啊 , 在下感激不尽!! |
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5楼2007-11-13 14:01:06
2楼2007-11-13 11:04:44
随风而过
银虫 (小有名气)
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1．取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。 2．用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。 3．依次加入： 10xbuffer 2.5 Mgcl2(25mM) 1.8 DNTP(2.5mM) 1 3'引物（10pmol） 1 5'引物（10pmol） 1 Taq酶 0.4 total 25ul 各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上 4．94℃，2min。 5． 94℃ 4分钟 94℃ 40秒 53.6℃ 40秒（此步骤温度视设计引物而定） 72℃ 4分钟 30-35个循环 72℃ 10分钟 4℃ 6．待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。 7．将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。 |
3楼2007-11-13 13:45:03
noblerenhb
木虫 (小有名气)
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4楼2007-11-13 13:58:50
