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shucaiyuanyi

银虫 (小有名气)

[求助] 求助菌落PCR的技术流程

求助菌落PCR的技术流程
查了好多资料,都没有详细的技术流程,希望各位帮下忙啊 ,
在下感激不尽!!

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noblerenhb

木虫 (小有名气)

可以参考这本书

基因工程实验指导

邢万金 扈廷茂 编写
2005年6月(第二次修订)
5楼2007-11-13 14:01:06
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Kiddy

金虫 (小有名气)

其实就和普通PCR一样,模板用菌液代替了,我们的惯例是菌液加5ul,总共20ul体系
2楼2007-11-13 11:04:44
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随风而过

银虫 (小有名气)

1.取适量PCR薄壁管,置于冰上,每管先加入17.3ul的灭菌水。
2.用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中,振荡混匀。
3.依次加入:
10xbuffer                  2.5           
Mgcl2(25mM)             1.8
DNTP(2.5mM)            1        
3'引物(10pmol)       1            
5'引物(10pmol)       1         
Taq酶                     0.4      
total                       25ul     
各试剂均加好后,离心机上甩一下,使之沉底,置于PCR仪上
4.94℃,2min。
5.                       94℃      4分钟
94℃      40秒
53.6℃    40秒(此步骤温度视设计引物而定)
72℃      4分钟
30-35个循环
72℃      10分钟
4℃      
6.待PCR反应进入4℃后,取下PCR薄壁管,取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳,同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相,观察胶图,根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。
7.将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。
3楼2007-11-13 13:45:03
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noblerenhb

木虫 (小有名气)

取样-总RNA提取-RNA吸光值测定计算浓度-RNA电泳-cDNA第一条链合成-PCR-PCR产物吸光值测定-PCR产物电泳-产物入T载体克隆-质粒DNA提取-酶切-测序
4楼2007-11-13 13:58:50
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