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[求助]
蛋白胶
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本人新手一枚，最近配蛋白胶总是出现一些问题，如图，胶中出现气泡，最常见的是浓缩胶和分离胶之间出现气泡。刚刚配出来没有，往往是在4度放一天后就有了。请高手多多指教，谢谢！ IMAG0030.jpg  IMAG0032.jpg |
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user59888
金虫 (文坛精英)
宫创始人 ------小妮
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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是按照这个方法做的吗 （1）10%AP（W/V）：:过硫酸铵（AP，引发剂） 0.1g，加蒸馏水至1.0mL，最好临时配制。 （2）电泳样品缓冲液：SDS 0.4g，巯基乙醇 1.0ml， 甘油 2.0ml， 0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8) 2.0 ml， 0.1%（W/V）溴酚蓝 0.5ml，ddH2O 2.5ml。 （3）30.8%凝胶贮存液：称Acr 30g及Bis 0.8g，溶于蒸馏水中，最后定容至100ml，过滤后置于棕色试剂瓶中，4°C贮存。 (4) 凝胶缓冲液 分离胶缓冲液：1.5mol/L pH 8.8 Tris-HCl。称取18.15gTris，用60ml重蒸水溶解，再用1mol/L的HCl调节至pH8.8，定容至100ml，4°C保存。 浓缩胶缓冲液：0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl。称取6g Tris，用60ml重蒸水溶解，再用1mol/L的HCl调节至pH6.8, 定容至100ml，4°C保存。 （5）10%SDS：将10g SDS溶于80ml蒸馏水中并轻缓搅拌（室温低时需水浴加入溶解）。 （6）电极缓冲液（内含0.1%SDS， 0.05mol/L Tris-0.384mol/L 甘氨酸缓冲液，pH8.3）：称 Tris 3.03g， 甘氨酸14.41g，SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。 (7) 固定液：取50%甲醇455ml。冰乙酸45ml混匀。 （8）染色液：称考马斯亮蓝R250 0.125g， 加上述固定液250ml，过滤后使用。 （9）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。也可用250ml 95%乙醇，80ml冰乙酸，加ddH2O至1L。 （10）95%乙醇。 (1)配胶 贮备胶 (12.5%) 分离胶 (10%) 浓缩胶(4%) ddH2O 3.4ml 4.2ml 3.1ml Buffer 2.5ml 2.5ml 1.25ml Acr+Bis（30.8%） 4ml 3.2ml 0.7ml 10%SDS 100ul 100ul 50ul TEMED 6ul 6ul 4ul AP 100ul 100ul 50ul |
2楼2013-08-19 09:38:24
3楼2013-08-20 08:00:11
4楼2013-08-20 19:45:11
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跟你溶液配制比较下，只有浓缩胶浓度有点区别（我们是1.0mol/L)，这应该没有啥大问题，其他都是差不多的。目测你图片，问题还是在分离胶上，这里注意几点：玻璃板一定要清洗干净，确保无粘附，自然晾干，（可以用酒精擦拭）；SDS配制时要充分溶剂，制胶时SDS溶液沿玻璃壁流下，充分混合；注意AP的现配现用和TEMED的加入次序。 我把我们实验室的情况简述下，以便你参考：室温下浇灌分离胶后，用水或异丙醇压胶30min左右，后罐浓缩胶，室温放置1~2h开始点样点样；另外是晚上10点左右制胶，方法同上，最后室温放置过夜，第二天早晨开始点样电泳。 实在不行，建议参考下《蛋白质电泳技术》相关教材，真诚祝你成功！自己的微薄之力，错误之处请勿吐槽！  |
5楼2013-08-21 08:17:32
feilinshiji
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