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无处自怨自艾

新虫 (小有名气)

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性别: GG
专业: 环境地球化学

[交流] 重组质粒克隆大肠杆菌扩大培养后提取的质粒无法扩增出目的基因，求助已有2人参与

大家好！我做反硝化功能基因克隆，前段时间，挑选白斑细菌在含氨苄青霉素的LB培养基里培养过夜后，提取出重组质粒，做PCR扩增，扩增出了目的基因。另剩下的1mL的菌液加甘油后，保藏在-20C冰箱。过了一个月，将保藏的克隆大肠杆菌接种到含氨苄青霉素的LB培养基培养过夜，提取质粒（经电泳检测，条带很亮）后做PCR，结果居然没有得到目的基因片段。不知道大家有没有遇到类似的情况。非常的郁闷啊！不知道为什么，请大家帮忙解答，不胜感激！

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1楼 2013-08-18 12:33:24

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ykluuniu

金虫 (小有名气)

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amisking: 金币+1, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-08-18 16:35:39

你是怎么鉴定你PCR出来的是你的目的基因的？PCR也可能有假阳性啊。应该鉴定你确实扩出了你的目的基因，然后再保种吧。光PCR不可靠。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

2楼2013-08-18 13:44:19

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15879003030

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amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-08-18 16:36:31

质粒做pcr确实会有很多问题。你如果是要继续验证你的克隆的话，用酶切就可以了啊。

如果是为了得到片段作其他用途，那换条件或者换酶试试。先用一般的r-taq试试，r-taq最好P。能p出来再用其他的酶试。

3楼2013-08-18 15:48:13

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