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橄榄树在飘

银虫 (正式写手)

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[求助] 有关含氨苄青霉素的固体培养基上大肠杆菌培养的问题已有2人参与

这几天在做质粒提取的实验，把含有氨苄青霉素抗性的质粒(我们一共转了四种不同的质粒，但每种质粒上都含有抗氨苄基因)转入大肠杆菌感受态细胞后，将该细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上培养（约在第一天下午3点左右完成），第二天早上7点左右观察，只有进行GFP-actin转染的细菌在培养基上长出来了，其他培养基上均无菌落长出。之后在中午12点左右观察发现其他培养上有很小很小的菌落长出，更悲剧的是连对照组（将未转染过的感受态细胞涂布于含氨苄的培养基上）也长出了细菌。
  这种情况，想请问一下各位：
  1：后来才长出的那些菌落是否是杂菌呢，而不是我们想要的转染入质粒的细菌。
  2：如果是杂菌生长，为何会产生这种现象呢？（网上有看到说可能是培养基中抗生素失效的原因）
  3：将菌落挑入含氨苄的LB培养基后，是否一定需要振荡培养。

谢谢了

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1楼 2013-08-18 10:32:36

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小小亚杰

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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laozuzunzhe: 金币+3, good！ 2013-08-19 19:46:35

1：后来才长出的那些菌落应该是杂菌。
2：amp很容易失效，正常状况下，37℃培养过夜，含amp抗性质粒的菌长的很快，16h左右就开始有卫星菌落生长。你能看见GFP-actin转染的培养基菌旁边也能长小杂菌。
3：液体培养需要振荡培养提供氧气。

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3楼2013-08-19 00:32:58

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Fleaves

至尊木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

后面长出来的菌落是卫星菌落，没有抗性的，也就是说你很可能没有转化成功

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2楼2013-08-18 17:34:30

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Sthunder

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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laozuzunzhe: 金币+4, good！ 2013-08-19 19:50:33

1：后来才长出的那些菌落是否是杂菌呢，而不是我们想要的转染入质粒的细菌。 2：如果是杂菌生长，为何会产生这种现象呢？（网上有看到说可能是培养基中抗生素失效的原因）

根据你的对照看，后来的菌是来自你感受态的菌，也就是说有两种可能，a 感受态感染了抗Amp的菌，b，你的Amp失效或者使用浓度过低。此外，楼上说说的卫星菌落是指你有阳性菌落，由于时间过长，菌落周围抗生素被分解而导致原被抑制的感受态细胞复活的现象，而你的菌很明显不是这样。建议新鲜配置Amp or提高你的Amp浓度，重新制备感受态，重新转化！

3：将菌落挑入含氨苄的LB培养基后，是否一定需要振荡培养。
菌体在液体培养基中是需要振荡培养的哈，否则会长得非常慢！！

Good luck！

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