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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有没有做过transwell的前辈？指点一下
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小雨莎莎

木虫 (正式写手)

[求助] 有没有做过transwell的前辈？指点一下

最近在做cell migration的实验，用的是密理博的transwell，8μm的，24孔板适用的那种独立包装的小室，因为以前没做过，所以先做了预实验，但是做了两次预实验都发现最后用结晶紫染色后什么都没有了，是什么状况呢？实验后处理流程大概是这样的：培养结束后，取出小室，用棉签擦掉小室内的膜上未穿过去的细胞，然后把小室悬挂于24孔板的well里，well里预先加入了0.6mL的4%多聚甲醛，室温固定10min，然后用PBS稍微清洗残留的多聚甲醛，包括在小室里的，然后悬挂浸泡在1%的结晶紫（ddH2O配制），20min，室温，然后用PBS洗去浮色。然后悬挂在24孔板里镜检。基本没看到细胞，但是因为在本来小室放置的对应的那个well里找到了少量的细胞，很少，个位数，说明是有穿过去的，但是为啥就是染不出来？难道在处理的时候掉了？哪位虫友帮忙解答一下？谢谢！
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1楼2013-08-13 16:32:58
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小雨莎莎

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by rockstonebob at 2013-08-13 23:14:44
哇。问题就出在这里，刚才没注意看。结晶紫要用甲醇配。...

但是我用来染那个皿里面的贴壁细胞是可以染上的哦~
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7楼2013-08-13 23:25:52
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rockstonebob

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小雨莎莎: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2013-08-13 22:38:52
silicare: 金币+6, BioEPI+1, 谢谢参与 2013-08-21 17:52:48
个人认为有可能的原因如下：
第一：细胞培养的时间很重要，也很难掌握，这个就看你自己对所培养细胞生长特性的了解程度了。长得久了穿出来的会太多，长的时间少了，穿出来会太少。像你这种情况有可能属于上述第二种，而且你找到了下室有细胞，不一定就代表穿出来了，因为如果穿出来太少，自然有可能脱落。我个人认为，掌握好细胞在小室中的培养时间长度是实验成功与否最关键的影响因素。为了这步能成功，建议铺细胞的时候多铺几个孔，然后培养相同长度的时间，只要你铺的孔够多，总会有那么几个孔在预计的时间内穿出令你满意的细胞术（当然，这样做是建立在经济基础上的），预实验也可以这样摸条件。
第二、建议取出小室后先4%多聚甲醛固定（可固定10-15分钟），然后再染色（0.5%的结晶紫15分钟为宜），最后再用棉签擦。先用极小流量的自来水冲洗小室柱子外侧，切记不要冲到小室底部，但是得冲过柱子侧面的水流过底面，后用棉签擦内室面，晾干、拍照。
第三、小室铺细胞的时候一定要均匀。要不然肯定是没细胞可穿了，大家都会集中在最中间，穿过去的也会脱落。
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小雨莎莎
当时明月在，曾照彩云归！
2楼2013-08-13 19:39:10
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小雨莎莎

木虫 (正式写手)
★ ★
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-09-10 19:01:52
引用回帖:
2楼: Originally posted by rockstonebob at 2013-08-13 19:39:10
个人认为有可能的原因如下：
第一：细胞培养的时间很重要，也很难掌握，这个就看你自己对所培养细胞生长特性的了解程度了。长得久了穿出来的会太多，长的时间少了，穿出来会太少。像你这种情况有可能属于上述第二种 ...

24孔板的transwell的话我是接种了4w个细胞每孔，按照有文献，我用的细胞跟它一样的，接种数量是文献说的3倍，处理时间相同，就是没有相同的结果啊~我是用1%结晶紫染的，结晶紫是用水配的，这个有没有影响啊？不过至少在染皿里面的贴壁细胞的时候是可以染上的
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3楼2013-08-13 22:43:25
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rockstonebob

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小雨莎莎: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢~貌似还真是跟这个有关系，重新配了之后强阳性对照染出来了~ 2013-08-14 22:11:24
137167741: 金币+2, 小木虫交流，共同进步~~ 2013-09-10 19:02:03
引用回帖:
3楼: Originally posted by 小雨莎莎 at 2013-08-13 22:43:25
24孔板的transwell的话我是接种了4w个细胞每孔，按照有文献，我用的细胞跟它一样的，接种数量是文献说的3倍，处理时间相同，就是没有相同的结果啊~我是用1%结晶紫染的，结晶紫是用水配的，这个有没有影响啊？不过至 ...

哇。问题就出在这里，刚才没注意看。结晶紫要用甲醇配。
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当时明月在，曾照彩云归！
4楼2013-08-13 23:14:44
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