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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆，假阳性？假阴性？
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怡红痴子

金虫 (小有名气)

[求助] TA克隆，假阳性？假阴性？ 已有1人参与

楼主初学TA克隆，经过一翻坎坷之后，终于小有成果，但是最近遇到了一个新的问题。
我是做土壤细菌氨氧化基因的TA克隆，目的片段大概490bp，用的载体试剂盒是TAKARA的pMD18-T，将PCR产物16℃过夜连接后，转入80uL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，LB液体37℃，200rpm摇1h后，离心浓缩至150uL菌液涂板（含100ug/mL氨苄），然后倒置37℃过夜培养（大约12h）。次日共挑取了78个单菌落分别接种到1mL氨苄LB液体培养基中37℃、200rpm培养12h，取1uL菌液进行PCR（采用M13-47和RV-M这对载体通用引物），但是菌液PCR验证结果只有29个阳性克隆，其中有一个还混入了空载体算是废掉了，只剩28个，可是78个只有28个是阳性，这比率也太小了点吧？
其他那49个没P出来的到底是氨苄筛选时的假阳性呢？还是菌液PCR时的假阴性？是不是我哪里没做好，请高人帮我分析一下原因，不胜感激！

PS：我同时做了阳性和阴性对照的，都很正常，阳性随机挑了9个菌落做PCR，验证结果都是阳性的

[ Last edited by 怡红痴子 on 2013-8-7 at 21:29 ]
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1楼 2013-08-07 21:11:32
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怡红痴子

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-08-08 18:22:14
我觉得效率也和载体本身有关系, 我用pGEM-T easy时大部分时候效率不到20%, 但是用TOPO-TA 一挑一个准. 当然这两个系统原理本身就不一样, 我的意思是楼主不用太在意效率, 我们绝大部分时候只要挑到克隆就行了.

嗯，但问题是我做的是环境样品，我的目的是建一个土壤细菌含有氨氧化基因的所有类群的文库，如果效率不高的话，很可能得不到可观的实验结果
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9楼2013-08-09 10:28:57
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cookee1981

银虫 (初入文坛)
怎么没有看到你在转化时的冰浴和热激这两步？
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2楼2013-08-08 10:49:23
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怡红痴子

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cookee1981 at 2013-08-08 10:49:23
怎么没有看到你在转化时的冰浴和热激这两步？

这两步当然做了的，只是在贴子里省略没写
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3楼2013-08-08 11:00:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-08 13:54:09
空载体也有氨苄抗性，所以抗性克隆不一定有insert，因此才要筛选。一般也不用筛那么多，用菌落PCR做十几个二十个就足够，把PCR阳性的克隆摇菌再提质粒做完整鉴定（通常还需要测序）后可以进行下一步克隆。一般做克隆阳性克隆的比例在50%以上，如果比例不是太低都是可以接受的。
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4楼2013-08-08 11:35:15
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