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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 大肠杆菌BL21表达包涵体的问题
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zcqh27

木虫 (正式写手)

[求助] 大肠杆菌BL21表达包涵体的问题 已有1人参与

本人利用一重组大肠杆菌BL21表达某种蛋白，蛋白最终是以包涵体的形式表达的。在摇瓶中先30°，200r/min培养，然后温度升高到42°诱导，4h后下摇瓶。
离心收集菌泥，然后用tris-hcl重新悬浮（w/v=1：10）,超声破碎菌体。
低温离心得到包涵体，并反复洗涤。
得到的包涵体直接跑电泳，有目的条带，而且含量较高。
包涵体变复性以后，跑电泳，也是有目的条带的，但是上液相检测，却什么也没有。
现在怀疑是两个方面出问题了，首先是菌株，会不会是菌株不能表达相关的蛋白了，但是为什么电泳还会有结果呢？另一个就是说变复性出问题了，但是即使变复性出问题，为什么跑电泳有结果，而液相检测却没有产物呢，况且变复性的方法换了好几种了，结果都不行。
哪位大神能提点建议啊！拜谢。
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1楼 2013-08-04 16:23:14
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zcqh27: 金币+2, 谢谢参与 2013-08-04 23:00:00
液相没有什么什么意思？是完全没有峰还是什么情况，你液相有连接质谱吗，不然你怎么知道你目的蛋白是否存在呢？一般情况下跑胶没问题就没多大问题，建议LZ做个质谱，结果一目了然！
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互助互励，共奋共进！！
2楼2013-08-04 22:15:06
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zcqh27

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-04 22:15:06
液相没有什么什么意思？是完全没有峰还是什么情况，你液相有连接质谱吗，不然你怎么知道你目的蛋白是否存在呢？一般情况下跑胶没问题就没多大问题，建议LZ做个质谱，结果一目了然！

我也是刚刚开始做这个，不是特别了解。因为我们的目标蛋白是有固定的出峰时间的，但是我的样品在相应的时间里跟本就没有峰，甚至都没有杂峰，至于质谱，好吧，这个我倒是不清楚。
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3楼2013-08-04 22:59:49
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by zcqh27 at 2013-08-04 22:59:49
我也是刚刚开始做这个，不是特别了解。因为我们的目标蛋白是有固定的出峰时间的，但是我的样品在相应的时间里跟本就没有峰，甚至都没有杂峰，至于质谱，好吧，这个我倒是不清楚。...

液相的话，你以前是跑过你的蛋白，即使如此，偶尔时间也会有所偏差，还是建议做质谱，呵呵！
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互助互励，共奋共进！！
4楼2013-08-04 23:37:57
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yfzhang2008

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zcqh27: 金币+2 2013-08-07 20:40:52
如果能确定电泳条带是目标产物，应该表达没有问题
可能是样品处理或液相条件需要改进
可以液相先做一个标准品看看保留时间，
当然有条件最好做个质谱
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佛祖对每个人都是公平的
5楼2013-08-07 08:19:23
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zcqh27

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yfzhang2008 at 2013-08-07 08:19:23
如果能确定电泳条带是目标产物，应该表达没有问题
可能是样品处理或液相条件需要改进
可以液相先做一个标准品看看保留时间，
当然有条件最好做个质谱

标准样和自己的样品电泳，条带是一致的，至少是有产品。液相，在标准品的出峰时间，自己的样品什么都没有。现在我怀疑，是不是蛋白表达稍微出了问题，使得蛋白分子量变化不大，但是蛋白结构变了，或者压根表达的时候就少了几个氨基酸。
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6楼2013-08-07 20:43:48
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hunter1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zcqh27 at 2013-08-04 22:59:49
我也是刚刚开始做这个，不是特别了解。因为我们的目标蛋白是有固定的出峰时间的，但是我的样品在相应的时间里跟本就没有峰，甚至都没有杂峰，至于质谱，好吧，这个我倒是不清楚。...

上样品的时候因为样品液体的问题有时候会出现目的峰时间提前或推后，所以，特定时间点没有波峰不能肯定又问题，有条件还是上个质谱
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7楼2013-11-27 13:19:05
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
8楼2016-05-21 14:33:50
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2016-05-21 14:35:01
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