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wklinyi

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助——构建载体

各位大虾。我想向pYES2(5.9kb)里插入一段1.5kb的基因。基因已经做了TA克隆。pYES2用hindIII和xba I酶切，基因用hind III和spe I酶切（xba I和spe I切出的片断互补） 胶回收用promega。回收浓度大约为20ng/ul。然后连接时，TAKARA的T4和ligation Mix,NEB的T4都试过。连接比例1：4，1：7，1：10都试过，就是不长啊。
有一次长出来几个，菌落PCR也P出条带了，但再提质粒时就什么都没。从那以后就一个菌落都没。
小弟都做了两个多月了，已经是厌学的情绪了。哪位大虾指点一下是哪的问题啊。

[ Last edited by 1949stone on 2013-7-23 at 10:27 ]
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1楼 2013-07-23 10:05:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wklinyi(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-23 11:13:31
我觉得克隆做不出来多半问题出现在酶切上。确定酶切没有问题吧。切载体片段时确定两个酶都完全切开（同样体系分别用单酶切对照）。连接一般问题不大，最好16°C过夜。
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2楼2013-07-23 10:48:26
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wklinyi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-23 10:48:26
我觉得克隆做不出来多半问题出现在酶切上。确定酶切没有问题吧。切载体片段时确定两个酶都完全切开（同样体系分别用单酶切对照）。连接一般问题不大，最好16°C过夜。

开始时我用空载体双酶切。始终不成功，怕是双酶切不完全。就又用实验室一个前辈构建的已经插入一个片段的质粒来双酶切，这样在电泳时看到两个条带，然后进行回收。应该不是酶切的问题啊
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3楼2013-07-23 10:56:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by wklinyi at 2013-07-23 10:56:33
开始时我用空载体双酶切。始终不成功，怕是双酶切不完全。就又用实验室一个前辈构建的已经插入一个片段的质粒来双酶切，这样在电泳时看到两个条带，然后进行回收。应该不是酶切的问题啊...

你怎么判断切空载体不成功？酶切是否成功，不是切出两条带就行了，大小是否正确？
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4楼2013-07-24 00:35:21
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wklinyi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-24 00:35:21
你怎么判断切空载体不成功？酶切是否成功，不是切出两条带就行了，大小是否正确？...

上次没说清楚。不是空载体没有切成功。是酶切空载体，然后连接转化，不成功。双酶切时，短的只有几十BP,基本是没法判断成不成功。所以找了一个插入一段序列的质粒来切，切出两条带。长度都没问题。
再补充一下我的连接体系。20ul体系。里面加载体5.3ul。长度5.9bp,约为0.03pmol.插入片段则0.12pmol,0.3pmol都试过。
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5楼2013-07-24 09:20:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
wklinyi: 金币+4, ★有帮助, 虽然问题没有解决，不过谢谢了 2013-07-28 20:19:23
引用回帖:
5楼: Originally posted by wklinyi at 2013-07-24 09:20:02
上次没说清楚。不是空载体没有切成功。是酶切空载体，然后连接转化，不成功。双酶切时，短的只有几十BP,基本是没法判断成不成功。所以找了一个插入一段序列的质粒来切，切出两条带。长度都没问题。
再补充一下我 ...

你做的连接体系大致没有问题，DNA量比我用的稍微多一点。一般载体用50ng就可以了，插入片段粘性末端的话3:1-4:1.
确定连接酶是否没有问题？
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6楼2013-07-24 12:53:33
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wklinyi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-24 12:53:33
你做的连接体系大致没有问题，DNA量比我用的稍微多一点。一般载体用50ng就可以了，插入片段粘性末端的话3:1-4:1.
确定连接酶是否没有问题？...

连接酶也连过其他东西。成功的。而且还试试过了TAKARA和NEB的T4以及TAKARA的ligation mix。都长不出来
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7楼2013-07-24 22:41:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by wklinyi at 2013-07-24 22:41:59
连接酶也连过其他东西。成功的。而且还试试过了TAKARA和NEB的T4以及TAKARA的ligation mix。都长不出来...

转化时是否做了正对照，感受态细胞是买的还是自己做的，好用吗？
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8楼2013-07-24 23:16:29
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-25 10:23:07
不要用别人有插入片段的质粒，这个质粒可能成开环了，或者半开环了，总之构建最好用新的空载体，大家都是这么用的，你的肯定也的可以的。每一个步骤的结果都要验证，每个试剂都要是好用的，一步一步往下做，肯定没有问题的。
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活到老学到老
9楼2013-07-25 08:39:01
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wklinyi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-24 23:16:29
转化时是否做了正对照，感受态细胞是买的还是自己做的，好用吗？...

做了正对照了。感受态是自己做的。我转17pg空质粒时，长出来88个菌落。
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10楼2013-07-25 11:07:46
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