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sars37

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] 转化后细菌提质粒,PCR条带很诡异

从板上挑的菌落都长的不是很好,基本上就只有几个菌落,挑完接种提质粒后PCR,发现条带只有100bp,目的基因有1000bp左右,而且还加了myc,为什么PCR之后就只有100bp了呢?
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by sars37 at 2013-07-23 10:41:52
你好,这个实验已经重复几次了,每次涂板后长出的菌落都不是均匀分布在板上,是集中在边缘,菌落连在一起,然后我挑的是在边缘上独立出来的几个菌落。...

第一,重复几次实验不代表你做的方式是正确的,先不要再重复了,好好分析一下你拿到的数据。
第二,你酶切的实验做过么?先看看你挑出的那几个菌落,即使是空载,确保载体是正确的,如果不对,长出来的就是一些污染了。
第三,返回去仔细看看你的酶切,纯化,连接的全部过程,分子的实验大体上来说过程就那些,不过做得好坏就靠自己的细心了。包括做对照组,排除你转化中过程或感受态的问题。
祝你好运
12楼2013-07-23 21:08:24
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xz2001199802

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
sars37(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-22 20:08:33
为什么不先用colony PCR确认之后,再提质粒,质粒提了之后,浓度是多少,有可能浓度高了,建议稀释一定倍数后再来PCR。并建议在质粒提取后做酶切,这样也能判断目的基因是否插入,插入方向是否正确
越学越无知
2楼2013-07-22 19:58:03
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84146922

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sars37: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-07-23 10:43:29
估计是引物二聚体
应该是假阳性
建议菌落PCR,才接种提质粒
3楼2013-07-22 20:48:52
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sars37(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-22 21:06:43
sars37: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-23 10:43:21
一般来说,1kb左右的片段,连接正常转换正常的话,不应该只有几个点
结果告诉你连接不是很成功,重新做连接转化了
4楼2013-07-22 20:48:58
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