应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 关于GatewayBP反应的很多问题——劳烦各位牛人
51/1返回列表
查看: 7506  |  回复: 23
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zhenglingyu

铜虫 (初入文坛)

[交流] 关于GatewayBP反应的很多问题——劳烦各位牛人

最近我一直在做Gateway入门载体BP反应。发现一些问题。
1.BP反应前需要设计一段加接头的基因特异性引物做全长基因pcr扩增，接头序列让我很捉摸不透。师兄告诉我
上游引物前附加：5'-3': GGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGA
下游引物前附加：5'-3': GGCGGCCGCACAACTTTGTACAAGAAAGTTGGGTA
可是我发现这跟官方说明书Gatewayman上面的attB PCR Primers序列不一样，我是菜鸟，真的不明白怎么回事，这对后面的BP反应有影响吗。
2.这两天做了BP反应连接转化，挑斑（过夜连接，每个平板大约10几20个斑，很少），然后菌落PCR（M13引物）发现5个基因的电泳条带基本上完全一致，700-800bp左右，而我的5个基因应该是1500bp左右，我捉摸着是不是都是空载体。会不会是都没连接上，也不知道是哪出了问题，用高保真酶扩基因全长条带都很单一也是目的片段，就是不知道为什么会这样，各位大侠牛人教教小女子吧！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2013-07-21 16:49:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

院里的枣

新虫 (初入文坛)
★
zhenglingyu(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
15楼: Originally posted by starseacow at 2013-07-22 18:07:46
我用的是
attB1 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggct
attB2 ggggaccactttgtacaagaaagctgggt

但楼主的引物没什么问题，有完整的BP作用位点。对于正常BP反应，如果你的感受态细胞没有问题，可以长出成百上千个菌落，只 ...

楼主的问题解决了吗，我做bp反应也遇到了类似问题，克隆30个基因的启动子，做完bp反应后，pcr验证发现假阳性特别高，基本没有，目的片段本来是差不多都是2000左右，用m13通用引物扩增，片段很多都小于500，怎么办，载体也换过试了，基因也重新克隆了，同样的问题，生无可恋了，期待楼主答复
赞一下 回复此楼
23楼2016-10-30 22:57:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 24 个回答

Sthunder

木虫 (正式写手)
★
zhenglingyu(金币+1): 谢谢参与
首先，你所用的引物与我所用的有所出入，我用的是：
F   5’  GGGG ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC
R  5’  GGGG ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT C
其次，BP不是连接哈，他是转换，无论BP OR LR对其浓度要求比较高，请严格按照其说明书要求进行，尤其是BP中的PCR产物浓度，LR中的pZeo浓度。
针对你的情况，建议做个酶切验证，挑取BP产物单克隆，提个质粒，然后用Mlu I 做个酶切看看。

Good luck！
赞一下 回复此楼
13楼2013-07-22 08:34:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 24 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0854 考研调剂 招生了！AI 方向 +3 pk3725069 2026-03-19 13/650 2026-03-23 11:00 by 汪！？！
[考研] 291求调剂 +5 孅華 2026-03-22 5/250 2026-03-23 09:20 by haoshis
[考研] 0854电子信息求调剂 +3 α____ 2026-03-22 3/150 2026-03-22 21:28 by zhq0425
[考研] 求调剂一志愿海大，0703化学学硕304分，有大创项目，四级已过 +6 幸运哩哩 2026-03-22 10/500 2026-03-22 20:10 by edmund7
[考研] 寻找调剂 +4 倔强芒? 2026-03-21 4/200 2026-03-22 16:14 by 木托莫露露
[考研] 305分求调剂（食品工程） +4 Sxy112 2026-03-21 6/300 2026-03-22 15:26 by 无懈可击111
[考研] 化学调剂 +5 yzysaa 2026-03-21 5/250 2026-03-21 22:12 by peike
[考研] 求调剂 +4 要好好无聊 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:57 by 学员8dgXkO
[考研] 278求调剂 +9 烟火先于春 2026-03-17 9/450 2026-03-21 17:47 by 学员8dgXkO
[考研] 313求调剂 +4 肆叁贰壹22 2026-03-19 4/200 2026-03-21 17:33 by ColorlessPI
[考研] 299求调剂 +5 shxchem 2026-03-20 7/350 2026-03-21 17:09 by ColorlessPI
[考研] 279分求调剂 一志愿211 +14 chaojifeixia 2026-03-19 15/750 2026-03-21 13:24 by zhukairuo
[考研] 265求调剂 +3 Jack?k?y 2026-03-17 3/150 2026-03-21 03:17 by JourneyLucky
[考研] 初始318分求调剂（有工作经验） +3 1911236844 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:33 by JourneyLucky
[考研] 330求调剂 +4 小材化本科 2026-03-18 4/200 2026-03-20 23:13 by JourneyLucky
[考研] 288求调剂 +16 于海海海海 2026-03-19 16/800 2026-03-20 22:28 by JourneyLucky
[考研] 353求调剂 +3 拉钩不许变 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:56 by JourneyLucky
[考博] 申博26年 +3 八6八68 2026-03-19 3/150 2026-03-19 19:43 by nxgogo
[考研] 0703化学调剂 +5 pupcoco 2026-03-17 8/400 2026-03-19 13:58 by houyaoxu
[考研] 一志愿南京大学，080500材料科学与工程，调剂 +4 Jy? 2026-03-16 4/200 2026-03-17 11:02 by gaoqiong
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭