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FAM荧光强度检测数值问题 已有7人参与
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| 每次用酶标仪检测FAM荧光强度时，设置三组，一样的东西为什么FAM的荧光值误差那么大？检测值为一万多的时候误差有3、4千，检测值为2千的时候误差有3、4百。。。请问是我加样的原因还是数值本身太精确啊。。。 |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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9楼2013-07-22 20:11:16
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Defintion of mPhotobleaching http://en.wikipedia.org/wiki/Photobleaching Photobleaching is the photochemical destruction of a dye or a fluorophore. In microscopy, photobleaching may complicate the observation of fluorescent molecules, since they will eventually be destroyed by the light exposure necessary to stimulate them into fluorescing. This is especially problematic in time-lapse microscopy. However, photobleaching may also be used prior to applying the (primarily antibody-linked) fluorescent molecules, in an attempt to quench autofluorescence. This can help to improve signal-to-noise ratio. Photobleaching may also be exploited to study the motion and/or diffusion of molecules, for example via the FRAP or FLIP techniques. Loss of activity caused by photobleaching can be controlled by reducing the intensity or time-span of light exposure, by increasing the concentration of fluorophores, by reducing the frequency and thus the photon energy of the input light, or by employing more robust fluorophores that are less prone to bleaching (e.g. Alexa Fluors or DyLight Fluors). To a reasonable approximation, a given molecule will be destroyed after a constant exposure (intensity of emission X emission time X number of cycles) because, in a constant environment, each absorption-emission cycle has an equal probability of causing photobleaching. Photobleaching是光漂白，光漂白影响的是荧光的消光系数，而不是荧光的波长变化。 荧光光谱的形状受到两个因素影响：1.各振动能级之间的跳跃概率，2.基态中的能级结构。荧光分子受到激发之后，吸收光子的能量，跃迁到更高级的激发态，荧光的高级的激发态有较大的分布范围，所以激发态光谱分布较宽，可能有存在多个吸收谱带，再由不同的激发态能级跃迁到基态，每一种跃迁的能量释放不同，所以可能有不同的激发态。俄而荧光物质的振动和内转化等非辐射的跃迁过程寿命很短，很快施放能量使分子衰变到激发单重态的最低振动能级，再有这个能级跃迁到基态，发射荧光分子。每一种荧光分子的激发单重态的最低振动能级与基态中的能级的能量值基本上是不变的，所以两者之间的差值决定了荧光分子的发射光谱，所以荧光分子的发射光谱的波长一般比较窄，只有一个谱带，与吸收光谱的波长无关。荧光发射光谱与外界的荧光激发光谱之间的波长通常有一定差值，叫所谓斯托克位移或者反斯托克位移，斯托克位移是荧光分子的发射波长比激发波长长，反斯托克位移是荧光分子的发射波长比激发波长短。 但是也有一些荧光分子的分子存在特殊性，激发波长变化时，荧光发射光谱会随之变化，也就是该种荧光分子受激发出的荧光不全是该种荧光分子的激发单重态的最低振动能级与基态中的能级之间能量差决定波长的荧光。 所以一般如果出现了荧光分子受激后出现多个波长时，尽量用一种外界的激发光谱（固定激发的光源）。 另外，荧光分子的具体的环境会引起Photobleaching（光漂白），尤其是针对某些波长的荧光，当有多个荧光时可能会剩下另外一些，有时高强度的荧光照射会引起Photobleaching（光漂白），荧光分子用量过大也会引起对某些发射波长的荧光出现Photobleaching（光漂白）。 |
4楼2013-07-16 10:48:30
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