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王芳边疆

金虫 (正式写手)

[求助] PCR产物非特异性条带的去除

PCR产物出现少量的非特异性条带，该条带与特异性条带间隔很近，使用PCR产物纯化试剂盒好还是割胶回收试剂盒好呢？
由图可以看出，F200、H200在240bp处拥有浓度很大的特异性条带，然而在其上方微弱的看到些条带，由于PCR条件摸索多次不能成功，预采用PCR产物纯化试剂盒或者胶回收试剂盒，可是初来乍到，对方法的选取有些迷茫，请各位前辈给予帮助
PCR产物非特异性条带的去除
FGHK240bp PCR产物 2013-07-14 20 小时 29 分钟_副本.jpg
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温暖定格
1楼 2013-07-14 20:56:34
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肃清华书

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-07-14 21:45:08
非特异性扩增没办法避免，一般的方法就是胶回收，如果在体系里面做的话尽量保持酶量减少和引物优化吧。
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2楼2013-07-14 21:31:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 17:45:04
如果条带在胶上能分开就切胶回收。PCR回收试剂盒只是把DNA片段吸附洗脱，除去dNTP和盐。
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3楼2013-07-14 23:50:15
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王芳边疆

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-14 23:50:15
如果条带在胶上能分开就切胶回收。PCR回收试剂盒只是把DNA片段吸附洗脱，除去dNTP和盐。

我还想弱弱的问一句，F200和H200泳道的条带上方一点点白色的影子是胶跑出来的痕迹还是非特异性条带呢？
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温暖定格
4楼2013-07-15 10:19:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 王芳边疆 at 2013-07-15 10:19:42
我还想弱弱的问一句，F200和H200泳道的条带上方一点点白色的影子是胶跑出来的痕迹还是非特异性条带呢？...

光从这张图上有些不是很好判断。如果你的PCR条件已经优化过了，你试试切胶的时候尽量不要切到上面。
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5楼2013-07-15 11:03:21
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-17 17:45:13
提高退火温度3-5度，应该可以避免非特异性条带。
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6楼2013-07-15 11:19:46
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你的PCR条件发过来看看。
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7楼2013-07-15 11:21:05
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
4楼: Originally posted by 王芳边疆 at 2013-07-15 10:19:42
我还想弱弱的问一句，F200和H200泳道的条带上方一点点白色的影子是胶跑出来的痕迹还是非特异性条带呢？...

这个不好说，但是你的目的条带绝对是大量的。先切胶回收了做连接，再pcr验证阳性克隆，再测序就行了！
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8楼2013-07-15 12:06:49
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得这个不是非特异性条带，这个PCR结果挺漂亮的。不放心的话可以测序验证一下，看有没有套峰。
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9楼2013-07-15 14:18:47
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maidi12

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
10楼2013-07-15 21:29:51
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