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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DNA的提取和纯化
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崔永霞

铁虫 (小有名气)

[求助] DNA的提取和纯化

各位高手好，这几天我在用CTAB法提取DNA，可是最后发现提取的DNA用TE稀释完之后有点粘稠，所以想用25:24:1纯化一下，可是不知道该怎么操作，是需要从加CTAB 开始再重复一遍实验流程吗？还是直接加CTAB?我是着直接加了CTAB,混匀之后离心完发现没办法取上清，因为上清只有一点点，根本取不起来，这可该怎么办啊？》求各位高人指点啦!
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每个人都有心底最柔软的地方，请不要触碰它，因为每个人都有自己的尊严！
1楼 2013-07-10 21:54:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-13 13:25:22
抽提后离心所得上清加入0.1体积3N NaAc(最好是pH5.2的)和2.5体积的无水乙醇混匀后，-20度或室温放置15min以上再12000gX15min收集DNA。
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伟大航线....
10楼2013-07-12 09:15:02
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-10 22:33:07
崔永霞: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2013-07-11 12:34:09
粘稠可能是因为浓度太高了。只要质量高，就没没事。可以跑胶看下条带的质量，是否是一条带，有无降解，最好测个浓度。。如果想纯化，可以从25:24:1开始。
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2楼2013-07-10 22:02:36
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protura

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
崔永霞: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2013-07-11 12:34:41
建议过离心柱纯化。
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3楼2013-07-10 22:38:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-11 12:21:59
崔永霞: 金币+2, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2013-07-11 12:32:01
样品定量或者跑胶观察了吗？浓度高的DNA溶液也是很粘的。如果只是浓度高，溶解不充分，可以多加点TE稀释一下。
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4楼2013-07-11 07:08:47
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励新虫交流 2013-07-11 12:22:07
崔永霞: 金币+2, ★★★★★最佳答案, 非常感谢！ 2013-07-11 12:31:40
粘稠有两种可能：
一是提的DNA浓度高，二是有一些杂质（例如多糖等）也会导致粘稠。
如果是一的情况那可以多加点TE稀释。[可测OD或电泳看看]
如果是二的情况则把DNA先稀释至约300-400ul，然后加用有机溶剂抽提一次。再抽提一次对去除杂质有一定帮助。
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伟大航线....
5楼2013-07-11 08:46:53
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2013-07-11 08:46:53
粘稠有两种可能：
一是提的DNA浓度高，二是有一些杂质（例如多糖等）也会导致粘稠。
如果是一的情况那可以多加点TE稀释。
如果是二的情况则把DNA先稀释至约300-400ul，然后加用有机溶剂抽提一次。再抽提一次对去 ...

我把DNA稀释到了500微升，再加25:24:1纯化之后感觉好像损失的好厉害，都看不到DNA了？这是怎么一回事啊？
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6楼2013-07-11 12:33:36
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by protura at 2013-07-10 22:38:40
建议过离心柱纯化。

离心柱纯化是不是损失会比较小点啊，可是该用什么样的离心柱比较好呢？
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7楼2013-07-11 12:36:35
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longrna

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 崔永霞 at 2013-07-11 12:33:36
我把DNA稀释到了500微升，再加25:24:1纯化之后感觉好像损失的好厉害，都看不到DNA了？这是怎么一回事啊？...

离心过柱损失比再手工抽提损失更严重。
你25:24:1r抽提可能没加NaAc。说说你的后面抽取具体操作。
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伟大航线....
8楼2013-07-12 08:33:08
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by longrna at 2013-07-12 08:33:08
离心过柱损失比再手工抽提损失更严重。
你25:24:1r抽提可能没加NaAc。说说你的后面抽取具体操作。...

我是直接加完25:24:1，混匀10分钟，离心取上清，再加无水乙醇洗了一次，最后通风厨里风干30分钟，加TE50微升稀释。完了检测吸光度A260就只剩下0.004了。这不是根本没有了吗？
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9楼2013-07-12 08:46:11
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