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[求助]
最近RNA提取出现问题，求助各位
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一直用一个试剂盒提RNA,最近出现一种奇怪现象 先附上操作步骤 (1)在液氮中将样品研磨成粉末，研磨后立刻将样品转移到Rnase-free离心管中。 (2)加入0.5ml预冷的pBIOZOL到0.1g样品粉末中，振荡混匀5min。室温放置5分钟(将离心管横置使接触面积最大)，12000 rpm，室温离心2分钟。 (3)将上清转移到新的Rnase-free离心管中，加入0.1ml 5MNacl，轻弹离心管（或用漩涡振荡）混匀。加入0.3ml氯仿，振荡混匀5min，静置分层，12000rpm，4℃离心10分钟。 (4)将上层水相转移到新的Rnase-free离心管中。加入等体积异丙醇，混匀后室温放置10分钟。12000 rpm，4℃离心10分钟。 (5)弃去上清，加1ml 75%乙醇溶液洗涤沉淀，吹打或轻弹使沉淀悬浮，12000 rpm，室温离心1分钟。 (6)弃去液体,短暂离心后，用移液器吸干残余液体，风干沉淀5min。 (7)加10-30Rnase-free水溶解RNA，保存于-80℃。 问题出现在最后沉淀的时候，平时用乙醇沉淀没有问题的，2.5体积，这两次发现用乙醇沉淀后，溶液变成乳浊液的样子，然后沉淀30min后离心，上层水相，中层沉淀层，底下居然出现大概20ul的不明液体物质，水溶性，非氯仿，只好溶解掉再抽提一次，然后就可以了，关键问题是，这个到底是什么原因啊？底下那层液体是什么东东啊？求大虾给解释下 |
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2楼2013-07-10 18:27:46
3楼2013-07-10 21:20:38
lmcyjxs
金虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
1988潇湘: 金币+5 2013-07-13 14:29:24
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1988潇湘: 金币+5 2013-07-13 14:29:24
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1 楼主的步骤里写着用异丙醇沉淀，后面说加乙醇沉淀有问题，虽然两者都可以沉淀核酸，但你到底是用什么沉淀的呢？ 2 建议严格按照试剂盒再做一遍，要检测自己的试剂有无加错，有无污染，环境各方面是否良好，出现的总会有原因，或者你问问买家，有无这种情况出现。 3 你沉淀的含RNA溶液里，肯定还含有其他物质，比如盐、未除尽的蛋白或其他试剂残留，假如这样的话，你加乙醇或异丙醇就很有可能很快出现乳状物，而且很明显的 4 至于你说底下不明液体，溶解后没事，那么不影响你的RNA质量，就说明没有影响，另外你确定它分成3层？有无可能是气泡？如果你再做一遍，还是这样，你拍个图上来给大家分析下？ 以上看能否帮上忙，祝好！ |
4楼2013-07-10 22:20:52
5楼2013-07-12 09:26:47
6楼2016-03-21 07:32:42
