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haitai2011

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jilly

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137167741: 金币+1, 小木虫交流,共同进步~~ 2013-07-10 21:36:19
haitai2011: 金币+5 2013-07-11 21:01:24
RT-PCR结果和预期的一样吗?
出现这种结果,要是RT-PCR结果和预期的一样的话,有可能质粒是假阳,可用酶切鉴定一下,会不会有目的条带出来,PCR比较容易出现假阳。最准备的鉴定就是测序了
2楼2013-07-10 10:38:57
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haitai2011

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3楼2013-07-10 21:05:55
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jilly

新虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
关键是双酶切的小带和你的目的片段大小是不是一样的?不是一样的话,说明质粒是假阳了。再不放心的话,可测序
4楼2013-07-11 02:00:23
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haitai2011

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5楼2013-07-11 10:33:38
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zhouking8758

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难道片段和质粒发生重组?
我遇到过质粒和E.coli 的基因组发生重组的现象。
可以先测序看看序列。
6楼2013-07-11 12:11:46
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haitai2011

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7楼2013-07-11 21:00:45
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jilly

新虫 (小有名气)



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引用回帖:
3楼: Originally posted by haitai2011 at 2013-07-10 21:05:55
双酶切的两条带 之和 和质粒的条带一样大,pcr也p亮了,但是就是和RT-PCR 结果不一样的...

双酶切的两条带之和,肯定会和质粒的条带一样
我觉得你这个质粒有九成是假阳性的
8楼2013-07-12 08:45:16
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zhouking8758

木虫 (正式写手)



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引用回帖:
5楼: Originally posted by haitai2011 at 2013-07-11 10:33:38
和我想要的目的条带不一样呢  差了快1000bp了
但是质粒PCR却P亮了...

质粒PCR的带和预期大小的带相差了1000bp,也有可能是质粒在细菌内增殖过程中发生了缺失。
前面我也说过,有可能是发生了重组。
这些情况我都遇到过。
只有测序才知道差的是哪一段以及其他详细信息。
另外,我不大赞同你的RT过程的问题。
你克隆肯定是RT后再PCR,得到正确长度的片段才进行后续的克隆,所以问题应该在克隆这一步,而不会与RT有关。
最后祝你实验顺利。
9楼2013-07-12 10:33:33
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