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meredithwong

铁虫 (初入文坛)

[求助] 关于植物合子胚的石蜡切片细胞破碎的问题,急求帮助!

各位大神好,我做的是毛梾合子胚的石蜡切片,用来研究胚的发育。但是每次做出来细胞都是破碎的,看起来细胞是空的,只剩下一个细胞的框架了;而且我用番红-固绿染色后片子染不上红色,只有一片绿色。。。如图(图是手机照的,不清晰请见谅)
       我制作石蜡切片过程如下,取毛梾合子胚,FAA(50%酒精)固定液固定24h,逐级脱水:15%,30%,50%,70%,83%,95%,100%,100%,每级20min,纯酒精每级10min;透明:1/2二甲苯+1/2酒精15min,二甲苯5min,二甲苯5min;浸蜡:加3次碎蜡38℃温箱45min,换纯蜡45℃ 30min,再换纯蜡58℃ 30min,然后包埋;切片厚度是8μm;然后番红-固绿染色。我以前也尝试过脱水1h,透明30min,浸蜡3d左右,可是不管用哪种程序做细胞都是破碎的,急死我了!!!请各位大神提点,到底是哪一步程序出了问题。谢谢啦!!
        需要说明的是这个合子胚很小(一半芝麻那么大),含水量很高,一碰就会破碎,不知这个会不会对切片的过程造成影响?要怎么调整?谢谢各位大神!!
关于植物合子胚的石蜡切片细胞破碎的问题,急求帮助!
IMG_20130326_114845.jpg
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重口味屌丝爱科学
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meredithwong

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wudiliusha at 2013-06-23 11:54:43
我不明白你明明是用50%的酒精固定后,还要用<50%的酒精进行脱水。你这明摆着要细胞涨裂么?我一般都是使用大于固定也浓度进行脱水。

一般对于组织比较嫩的,你固定液浓度可以小一点。

看你这操作也应该是在 ...

好的,谢谢你。固定液酒精浓度可以低到30%吗?
重口味屌丝爱科学
5楼2013-06-28 22:36:29
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wudiliusha

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我不明白你明明是用50%的酒精固定后,还要用<50%的酒精进行脱水。你这明摆着要细胞涨裂么?我一般都是使用大于固定也浓度进行脱水。

一般对于组织比较嫩的,你固定液浓度可以小一点。

看你这操作也应该是在脱水的过程中有问题,后面切一般不会造成这种结果。
认真生活,快乐工作。
2楼2013-06-23 11:54:43
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q317476148

铁杆木虫 (著名写手)

喵星人

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你脱水时间是不是太短了。首先应该拿70%的酒精脱吧。至少也得一个小时吧。浸蜡的时间也太短了,最好升高点温度加长点时间。
3楼2013-06-24 11:39:24
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lion1998

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
lz用的FAA固定液是甲醛+乙酸+水吧?如果是的话应该没有什么问题。对于含水量高的材料,除了脱水过程要延长一些(我们一般能增加到30min/次),前面固定的时候,要真空抽气的。另外,不知道是楼主没有写清还是怎样,从二甲苯到石蜡这一步,也是需要比例梯度的,3:1,1:1,1:3,直到纯石蜡,每步我都是浸≥4小时的。
lz不要灰心,胚的大小没有影响,我做的材料种子只有三分之一芝麻大小,胚一样可以切出来的,实在不行你就换环氧树脂切,毕竟锇酸戊二醛固定,丙酮脱水效果更好
Iamaleafonthewind.
4楼2013-06-24 16:07:18
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