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wzc4884

金虫 (正式写手)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 414.8
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在线: 58.2小时
虫号: 549544
注册: 2008-04-21
专业: 生物化学

[求助] 求助，急，谢谢！

大家好！最近在使用荧光定量PCR对某个基因进行分析。当时设计PCR引物时，是使用NCBI设计的。使用阳性的cDNA进行PCR后，得到的条带也与目的条带相符。最近想通过TA克隆的方法对各引物进行验证，但是克隆及测序均不成功，请问到底是什么原因呢？自己百思不得其解，想请教大家，帮下忙，急呢，谢谢！
1. 下面是确定阳性cDNA验证的结果，D8、L816代表两个cDNA（1.jpg）

2. 下一步以验证的阳性cDNA进行PCR（目的条带均小于200bp，且与设计的预测扩增片段大小相符）--（2.jpg）

3. 然后切胶回收，并连接至PMD19T载体上，之后便是转化至感受态DH5ɑ中
4. 最后通过蓝白斑筛选，挑斑，摇菌扩增培养，使用M13对菌液进行PCR扩增

总结：蓝白斑筛选过程中，不知道我连接成功没有？主要的问题还出现在对菌液进行验证一步，因为目的条带小，我不知道怎样设计阳性、阴性对照，同时，我第一次PCR检测后将似乎是阳性的菌液（就是目的条带+200bp左右）送测序，但是奇怪的是：通用引物（华大）测序结果比对竟然是PUC系列克隆载体类似的结果。我不知道怎样来进行验证了，急啊，谢谢了，请大家帮忙，谢谢了。
请问：怎样对荧光定量引物进行验证呢？其次，TA克隆后测序怎么我的不成功呢？

1.jpg