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huanyi

金虫 (小有名气)

[求助] 帮我看看我的PCR那可能出了状况~

大家好~本人初次接触微生物,老师要求做个菌群分析~
用的引物是古菌的109和518,这个PCR出来为什么这么模糊,背景也很白~我到目前为止不会看图,只是与别人的比觉得不好,没有达到目标效果。。大家能不能分析下?(没有mark,四个都是模板)
帮我看看我的PCR那可能出了状况~
第一次PCR.JPG
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 严重同意 2013-06-19 07:05:27
我觉得挺好的啊, PCR的产物比较少所以曝光时间长了点造成图片的背景较强. 不过marker下次一定要带.
2楼2013-06-18 23:23:23
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 严重同意 2013-06-19 07:05:45
有引物二聚体,可以优化下减少二聚体,同时点mark ,确认大小
3楼2013-06-18 23:43:24
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huanyi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-06-18 23:23:23
我觉得挺好的啊, PCR的产物比较少所以曝光时间长了点造成图片的背景较强. 不过marker下次一定要带.

这样可以吗?第一次做,老师又不懂,自己的分析,与别人比较觉得条带不亮,而且背景很白。我想着下一步做DGGE,不知道行不行。
专注于最重要的那件事,但也不要拒绝其他的
4楼2013-06-19 08:39:32
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huanyi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-06-18 23:43:24
有引物二聚体,可以优化下减少二聚体,同时点mark ,确认大小

恩,我们做的其他样品都或多或少有引物二聚体,同学收是药品问题,不知道你们用的哪个厂家?
专注于最重要的那件事,但也不要拒绝其他的
5楼2013-06-19 08:40:33
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-19 09:59:23
huanyi: 金币+5, 有帮助, 好的,谢谢啊~~菌群分析,就是想看看有什么菌,分析一下有哪些产甲烷菌~第一次就看看有没有P出来,还以为marker可以不放。。 2013-06-19 11:55:50
照相时用凝胶成像仪的软件可以调节的,效果会好很多的,胶的颜色白不是问题╮(╯_╰)╭

关键看你的条带:四个都有清晰单一条带,第3道结果最好;由于你没加marker,无法判断大小和产物的量,下次一定要加~~有一些二聚体,不过优不优化影响不大。

对于“菌群分析”不太了解,不知道你的目的,不过感觉这结果可以,最多也就是需要优化一下。

纯属个人拙见。。。
岂能尽如人意,但求无愧我心
6楼2013-06-19 09:09:14
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-06-19 10:58:25
huanyi: 金币+4, 有帮助, 谢谢 2013-06-19 11:57:25
二聚体主要是引物设计时候出现的问题。。可以选用一些引物设计软件对引物分析,减少二聚体的形成。。当然如果哦引物上无从下手,可以通过热处理来消除引物二聚体。
7楼2013-06-19 09:09:22
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huanyi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by bleach060452 at 2013-06-19 09:09:14
照相时用凝胶成像仪的软件可以调节的,效果会好很多的,胶的颜色白不是问题╮(╯_╰)╭

关键看你的条带:四个都有清晰单一条带,第3道结果最好;由于你没加marker,无法判断大小和产物的量,下次一定要加~~有一些 ...

我想再问下,这种情况,可以进行DGGE不??
专注于最重要的那件事,但也不要拒绝其他的
8楼2013-06-19 11:56:23
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huanyi

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-06-19 09:09:22
二聚体主要是引物设计时候出现的问题。。可以选用一些引物设计软件对引物分析,减少二聚体的形成。。当然如果哦引物上无从下手,可以通过热处理来消除引物二聚体。

这点引物二聚体会影响下一步的DGGE吗?
专注于最重要的那件事,但也不要拒绝其他的
9楼2013-06-19 11:57:12
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bleach060452

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by huanyi at 2013-06-19 11:56:23
我想再问下,这种情况,可以进行DGGE不??...

老实说我不太了解DGGE,所以二聚体会不会影响,我不敢说。

要是通过切胶回收纯化一下呢?肯定没有二聚体了,但是是否会对PAGE有影响就不知道了(我感觉没事)
岂能尽如人意,但求无愧我心
10楼2013-06-19 12:58:15
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