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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 总是提不出来细菌基因组DNA
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werty1245

新虫 (初入文坛)

[求助] 总是提不出来细菌基因组DNA已有1人参与

最近一直手提屎肠球菌的基因组DNA，开始用的是6μl 50mg/ml溶菌酶，37℃3h；10%SDS和蛋白酶K，55℃2h；5M NaCl；酚氯仿异戊醇抽提两次；2倍体积无水乙醇洗脱；75%酒精洗涤，离心，烘干。一直提不出来，后来又用CTAB/NaCl法，也没提出来，谁提出来过，教教我~~~
小妹不胜感激~~~
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1楼2013-06-09 10:16:09
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提完以后测浓度了吗，或者跑过电泳吗？
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2楼2013-06-09 10:35:35
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werty1245

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-06-09 10:35:35
提完以后测浓度了吗，或者跑过电泳吗？

跑过电泳，很干净，什么都没有
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3楼2013-06-09 11:09:12
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
werty1245(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-06-10 16:56:22
我都是用试剂盒提的，一般不会有问题，有时候DNA浓度有点低。我看过别人的帖子，手提提不出来。也有可能你的浓度太低，用nanodrop测一下
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4楼2013-06-09 12:16:38
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lmcyjxs

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-09 21:53:14
gyesang: 回帖置顶 2013-06-10 16:56:31
保证提取过程中每一步准备到位。我没提过细菌的，提的都是木本的组织，用的是异硫氰酸胍法，细菌理论上是比较好提的，
1 注意用量要足够
2 注意试剂及试剂配制没有问题
3 注意操作要细心，细菌蛋白含量应该比较多吧，可以结合氯仿多抽几次，提一点，酚氯仿是自己配的吗？注意要用Tris饱和酚
4 可以买个试剂盒试试。
5 提完不要只跑电泳，要去测纯度和浓度去发现问题，比如是否蛋白含量过高，杂质过多影响电泳观察，这完全是可能的，还有是否因为染料过期问题影响观察等等。
每一步都要注意，多总结，多观察。
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思路决定出路。。。
5楼2013-06-09 12:17:01
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他她0328

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-06-10 16:56:39
提基因的时候，酚抽提这一步很重要，要完全混成乳浊液才行，我以前也是一直都提不出来，现在很容易了
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6楼2013-06-09 15:09:29
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werty1245

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 他她0328 at 2013-06-09 15:09:29
提基因的时候，酚抽提这一步很重要，要完全混成乳浊液才行，我以前也是一直都提不出来，现在很容易了

混成乳浊液？能说清楚一些吗？
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7楼2013-06-09 20:04:35
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werty1245

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 夏天的普洱茶 at 2013-06-09 12:16:38
我都是用试剂盒提的，一般不会有问题，有时候DNA浓度有点低。我看过别人的帖子，手提提不出来。也有可能你的浓度太低，用nanodrop测一下

用的什么试剂盒啊？
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8楼2013-06-09 20:09:14
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夏天的普洱茶

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by werty1245 at 2013-06-09 20:09:14
用的什么试剂盒啊？...

我用的生工的一个细菌基因组提取试剂盒，跟操作也有关系的，我刚开始老是提不出来，你每一步按照说明做就可以了。祝实验顺利
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9楼2013-06-10 14:15:13
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植语

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-24 21:32:22
用酚氯仿抽提混匀的时候力度大一点，刚混完后，整管都是乳浊液，不会上下分层，再静置10min，女生就是这样，用力太轻柔，使蛋白很难抽提出来，最后带着基因组一起沉淀了。
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10楼2013-06-23 07:50:40
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