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liuqingpucy金虫 (著名写手)
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westernblot 目标蛋白无条带 已有4人参与
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| 我做的westernblot目标蛋白是P-Akt（60kDa），内参为GAPDH（37kDa），转膜时间为100V 1.5h 湿转，marker都转了上去，做出来GAPDH条带很好，P-Akt却没有条带，这是什么原因啊？？？求助 |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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凌波丽
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【答案】应助回帖
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一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ： 原因分析 解决办法 1.一抗和二抗失效 1. 更换抗体；选择现用现配的工作液 2.一抗和二抗不匹配 2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物 3.发光液失效 3. 更换新的发光液 4.抗体染色不充分 4. 增加抗体浓度；延长孵育时间 5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低 5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质； 增加样品 的上样量。 6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂 6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂 7.抗体活力降低 7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配 二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。 |
9楼2014-07-12 00:05:04
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ericyo918
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