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liuqingpucy

金虫 (著名写手)

[求助] westernblot 目标蛋白无条带 已有4人参与

我做的westernblot目标蛋白是P-Akt(60kDa),内参为GAPDH(37kDa),转膜时间为100V 1.5h 湿转,marker都转了上去,做出来GAPDH条带很好,P-Akt却没有条带,这是什么原因啊???求助
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

可能Akt的量比GAPDH太少,尤其是在一起曝光;提取蛋白时要加磷酸酶抑制剂,防止p-Akt去磷酸化。
8楼2014-02-13 09:03:47
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annyuan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
liuqingpucy: 金币+2, 有帮助 2013-06-06 20:31:20
amisking: 金币+6, 鼓励新虫发帖交流,欢迎常来! 2013-06-06 22:02:36
会不会是抗体的原因?一抗没有与膜上的P-Akt有效结合。你有设置阳性对照吗?
2楼2013-06-06 17:06:04
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
liuqingpucy: 金币+2, 有帮助 2013-06-06 20:31:26
wizardfan: 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-06-07 08:46:40
P-Akt一抗是自己做的么?需要先找抗体的原因。可以先做个elisa试试
3楼2013-06-06 17:07:22
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秋水素心

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
liuqingpucy: 金币+2, 有帮助 2013-06-06 20:31:33
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析 2013-06-07 08:46:30
如果你确定你的蛋白有表达的话,就是抗体的问题,最大的问题估计在抗体浓度上
认真过好每一天!
4楼2013-06-06 18:25:29
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