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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » westernblot 目标蛋白无条带
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liuqingpucy

金虫 (著名写手)

[求助] westernblot 目标蛋白无条带 已有4人参与

我做的westernblot目标蛋白是P-Akt（60kDa），内参为GAPDH（37kDa），转膜时间为100V 1.5h 湿转，marker都转了上去，做出来GAPDH条带很好，P-Akt却没有条带，这是什么原因啊？？？求助
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1楼 2013-06-06 16:38:08
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nrahouston

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你做的p－AKT WB，先确定你的细胞是被激活的，有磷酸化的AKT（473或308），而且在细胞裂解中，除了常规的蛋白酶抑制剂之外，最好要加上磷酸酶抑制剂，增强信号。
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10楼2014-07-12 06:52:41
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annyuan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuqingpucy: 金币+2, ★有帮助 2013-06-06 20:31:20
amisking: 金币+6, 鼓励新虫发帖交流，欢迎常来！ 2013-06-06 22:02:36
会不会是抗体的原因？一抗没有与膜上的P-Akt有效结合。你有设置阳性对照吗？
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2楼2013-06-06 17:06:04
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuqingpucy: 金币+2, ★有帮助 2013-06-06 20:31:26
wizardfan: 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-06-07 08:46:40
P-Akt一抗是自己做的么？需要先找抗体的原因。可以先做个elisa试试
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3楼2013-06-06 17:07:22
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秋水素心

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuqingpucy: 金币+2, ★有帮助 2013-06-06 20:31:33
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析 2013-06-07 08:46:30
如果你确定你的蛋白有表达的话，就是抗体的问题，最大的问题估计在抗体浓度上
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认真过好每一天！
4楼2013-06-06 18:25:29
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