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这算是包涵体吗？
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这个问题是困扰我好长时间了。我构建了一个重组菌，全细胞活性很高，但是在破碎这一步，怎么也破不出来，沉淀里目标蛋白很多，上清很少，曾怀疑过是包涵体，但是破碎后沉淀还是有很高的活性（用200w功率破时，比上清的活性高）。 我做的尝试： 1我试过改变破碎条件，增加功率和破碎时间。当增加到400w时，上清活性上去了（比全细胞活性差远了），沉淀活性低了，但是蛋白电泳显示沉淀里的蛋白还是特别多，上清少。这是怎么回事啊？是包涵体吗？ 2.怀疑是包涵体，所以试着改变诱导条件，降低IPTG浓度，甚至用乳糖诱导，降低诱导温度，但是还是这样，破碎液很白，不透明，蛋白电泳结果也是这样。但是我用未诱导的重组菌做对比，发现破碎液透亮了。 请问，这一系列的实验，能说明是包涵体吗？ |
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4楼2013-05-30 15:57:59
cicelyzh
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我觉得应该是包涵体。未诱导的菌超声能破，说明超声程序是没问题的。当然，不排除诱导后的菌体不如为诱导的好破。你的上清和沉淀跑电泳，并不能说明蛋白在上清和包涵体里面的比例。因为存在一个破损率的问题。未破的菌体用SDS上样缓冲液处理后会破碎。你应该在超声前取一定体积的菌体。用上样BUFFER直接破碎菌体得全菌蛋白。然后用超声后同样体积的上清跑可溶蛋白。再比较目的蛋白在上清和全菌蛋白中的比例。 如果你已经尝试了改变诱导条件，效果都不理想，你可以试试直接纯化包涵体后复性。如果能获得活性蛋白，就不用纠结是在上清里还是沉淀里的问题了。 |
2楼2013-05-28 08:17:36
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kedaxiaoyu
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5楼2013-05-30 16:28:20
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