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残刀无痕

新虫 (初入文坛)

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虫号: 2087312
注册: 2012-10-26
专业: 作物分子育种

[交流] 研一小硕构载体吐血求助已有6人参与

由于本人是农学背景，基本没学分子生物学等课程，不懂的东西太多了，实验一直不太顺，载体构了将近一学期了都没弄出来，还被老板批过！
本人要构两个载体，先从拟南芥基因组中用普通Taq酶扩了两个启动子（后面才知道要用高保真酶啊

）。A启动子连上后送去测序，发现有两个碱基突变，不知道能不能用？[/i]B启动子一直连不上，感觉比例、酶切微点什么的没问题啊！不知什么原因？
现在要不要用Phusion酶从拟南芥中再次扩这两启动子以保证序列完全对呢？[/i]

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1楼 2013-05-22 16:50:39

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哈图萨斯90

铜虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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虫号: 1815060
注册: 2012-05-14
专业: 植物生理与生化

★
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引用回帖:

6楼: Originally posted by zhangj0754 at 2013-05-23 14:22:43
我们一般是用TAKARA的PrimeSTAR酶扩，然后连全式金的pEASY-Blunt 载体，测序，再双酶切，我一般切4小时，回收片段测浓度，载体与片段比例一般1：10，载体用100ng左右，我们用TAKARA的连接酶，20ul 体系，16度一般连 ...

请问你们回收片段用什么试剂盒回收的啊？测浓度时用仪器还是电泳呢？像酶切产物回收我们很少能回收出浓度超过10ng/ug的，如果载体用100ng的话就要超过酶连体系范围了。
谢谢！