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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量扩增效率低
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蓝慧

木虫 (正式写手)

[求助] 荧光定量扩增效率低

如题，在做荧光定量标曲的时候，目的基因的扩增效率很低，但是方程线性很好。用的是天根的fp204定量试剂盒，20微升体系(Mix 10ul, forward primer 0.6ul, reverse primer 0.6ul, DNA 2ul, 50X ROX 0.2ul, ddH2O 6.6ul), 反应条件是95度15min, 40 cycles的95度15s, 60度30s, 72度30s. 不知道如何处理，请大家帮忙解决下，谢谢大家！

扩增曲线与标准方程.jpg



溶解曲线.jpg
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1楼 2013-05-18 18:39:35
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zgb1982

木虫 (正式写手)
从哪里看出扩增效率低了
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2楼2013-05-18 19:06:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2013-05-19 08:00:18
蓝慧(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-19 10:24:00
从你的标准曲线方程上的斜率看，扩增效率还不错的吧。
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3楼2013-05-19 03:30:25
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zgb1982 at 2013-05-18 20:06:20
从哪里看出扩增效率低了

效率不是要达到95%-105%之间吗？这个还是没有达到啊，斜率的话应该还要小一点吧。
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4楼2013-05-19 07:58:32
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-19 04:30:25
从你的标准曲线方程上的斜率看，扩增效率还不错的吧。

一般来说效率不是要95%-105%之间吗？这个还没有达到要求啊。不知道怎么弄呢
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5楼2013-05-19 08:00:09
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2013-05-20 09:26:02
引用回帖:
5楼: Originally posted by 蓝慧 at 2013-05-19 08:00:09
一般来说效率不是要95%-105%之间吗？这个还没有达到要求啊。不知道怎么弄呢...

是稍微超出了一点，不过你的扩增效率是稍微偏高了一点。你可以试试用不同的退火温度。
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6楼2013-05-19 12:11:30
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andywang6137

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
蓝慧: 金币+1, ★有帮助 2013-05-20 09:25:32
90-110%就行，不要纠结这一点小问题，继续往下走。最可能的原因模板里边含有反应抑制剂。
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7楼2013-05-20 08:48:53
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by andywang6137 at 2013-05-20 09:48:53
90-110%就行，不要纠结这一点小问题，继续往下走。最可能的原因模板里边含有反应抑制剂。

原来如此，谢谢
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8楼2013-05-20 09:25:10
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蓝慧

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-05-19 13:11:30
是稍微超出了一点，不过你的扩增效率是稍微偏高了一点。你可以试试用不同的退火温度。...

那我再试一下，3Q
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9楼2013-05-20 09:25:53
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