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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR与巢式PCR能结合吗？主要怕扩增出同源基因。
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hobeny

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR与巢式PCR能结合吗？主要怕扩增出同源基因。

背景 我要用qRT-PCR检测一个转进去基因的表达，但是那个基因已经被发现在目标植物中有三个同源基因，而且同源性特别高，碱基的相似性差不多有百分之九十左右。
疑问1：巢式PCR似乎可以应对于这种相似性高的基因之间的区别，我也有搜到有文章有人把这个巢式PCR和荧光定量PCR结合，就是在巢式第一次PCR之后，稀释产物，再做第二次PCR，第二次PCR中加入taqman探针用荧光定量PCR仪检测。但是我不明白的是这种方法里，第一次PCR时，产物的量会不会到20几个循环或者若干后循环后就达到一个阈值了。那第二次PCR的时候，信号不就不准了吗?
疑问2：不用巢式PCR，直接就设计一对引物，然后用taqman探针法来做荧光定量在我的实验中可行吗？ 如果可行的话，为啥人家还要用两种方法联合呢。。。
另外，或者请高手们指教一下有什么别的好的方法啊，别人在遇到这种同源性基因多的荧光定量的时候一般都是咋干的呀。

新手，大家不吝赐教！
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1楼 2013-05-10 15:42:58
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hobeny

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 414713 at 2013-05-15 02:04:21
我遇到这种情况后，解决的办法很简单，根据目的基因和同源序列差异区域设计半定量引物，做半定量验证

兄台的意思是不是说目的基因内想扩增出100~300BP的片段不是很容易？所以设计半定量引物的话，不用考虑太多片段长短？
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5楼2013-05-27 10:36:41
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414713

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
hobeny(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-15 08:43:04
hobeny: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 谢谢兄台的回复 2013-05-17 12:57:45
我遇到这种情况后，解决的办法很简单，根据目的基因和同源序列差异区域设计半定量引物，做半定量验证

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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heweisc
2楼2013-05-15 02:04:21
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