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啊虫木

新虫 (初入文坛)

[求助] 用简并引物跑PCR跑不出条带，愁死了

最近克隆一种药用真菌的漆酶基因，跑了四五次了，总是跑不出条带，除了maker啥也没有。PCR的退火温度每次都设置了10个梯度（最高55，最低45）。

简并引物（引物本身不知可不可行，求鉴定）：
引物1：5′-CA (C/T) TGGCA (C/T) GG (C/T) TTCTTCCA-3′
引物2：5′-TGGCA (A/G) TGGA (A/G) GAACCACGG-3′
加样体系（25μL）：
2.5μL 10×PCR Buffer（Mg2+）
2.0μL dNTP Mixture
1.0μL primerL1
1.0μL primerL2
2.0μL 模板 DNA
0.2μL ETaq
16.3 ddH2O
反应程序：
1. 94℃ 5min；
2. 94℃ 1min，50℃（有梯度，45-55） 45s，72℃ 2min，35 循环；
3. 72℃ 5min。
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1楼 2013-04-26 08:59:09
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sj082csh

银虫 (小有名气)
引用回帖:
20楼: Originally posted by Crescendo at 2014-01-09 18:11:16
朋友你好！看到你在的有关简并引物设计的帖子，想请教一下：我用codehop设计的几对引物为什么总是扩增不出来目的条带呢？我做的是普通pCR，用的酶是takara LA酶。你是怎么做的？具体怎么操作？谢谢！...

您好, 我之前用的是iCODEHOP设计的简并引物，不是用CODEHOP设计的。 iCODEHOP网站现在貌似打不开了，我没用CODEHOP设计过，它的界面不如icodehop友好，具体有什么差别我不太清楚。  我有3个基因都是用icodehop设计简并引物跑出条带。  我个人建议，如果您的目的基因的同源基因的核酸序列比较保守的话，不需要用它们设计引物的。可以直接从NCBI上下载序列，然后进行同源比对，在保守区域设计几对引物，存在的个别碱基的差异应该用简并碱基代码替代（简并度不要太高）。
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24楼2014-01-13 14:58:45
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-26 10:43:21
不知道靶标序列光有引物有啥用啊。是不是抽提出问题了，片段多大A啊
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2楼2013-04-26 09:48:48
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啊虫木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bloodwar at 2013-04-26 09:48:48
不知道靶标序列光有引物有啥用啊。是不是抽提出问题了，片段多大A啊

片段1600bp左右，抽提还可以。这个引物是根据真菌漆酶保守氨基酸序列设计的，有文献用过的。大神，指点下啊
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3楼2013-04-26 09:53:28
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也碰到过，用文献上所给的通用引物，怎么都扩不出来，后来我用了高保真酶，竟然扩出来了，楼主不妨试一试。
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4楼2013-04-26 10:06:20
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