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啊虫木

新虫 (初入文坛)

[求助] 用简并引物跑PCR跑不出条带，愁死了

最近克隆一种药用真菌的漆酶基因，跑了四五次了，总是跑不出条带，除了maker啥也没有。PCR的退火温度每次都设置了10个梯度（最高55，最低45）。

简并引物（引物本身不知可不可行，求鉴定）：
引物1：5′-CA (C/T) TGGCA (C/T) GG (C/T) TTCTTCCA-3′
引物2：5′-TGGCA (A/G) TGGA (A/G) GAACCACGG-3′
加样体系（25μL）：
2.5μL 10×PCR Buffer（Mg2+）
2.0μL dNTP Mixture
1.0μL primerL1
1.0μL primerL2
2.0μL 模板 DNA
0.2μL ETaq
16.3 ddH2O
反应程序：
1. 94℃ 5min；
2. 94℃ 1min，50℃（有梯度，45-55） 45s，72℃ 2min，35 循环；
3. 72℃ 5min。
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1楼 2013-04-26 08:59:09
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sanmiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
啊虫木(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-29 14:03:31
高保真的酶，takara 的pyrobest，Thermo的Phusion，还有FastPfu都可以！效果都很好:

还有，2ul的模板，是不是有点多啊，有的时候模板浓度需要很少就可以了，多了里面有抑制成分，反而P不出来；一般5-10ng就可以了！
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10楼2013-04-27 09:44:39
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-26 10:43:21
不知道靶标序列光有引物有啥用啊。是不是抽提出问题了，片段多大A啊
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2楼2013-04-26 09:48:48
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啊虫木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bloodwar at 2013-04-26 09:48:48
不知道靶标序列光有引物有啥用啊。是不是抽提出问题了，片段多大A啊

片段1600bp左右，抽提还可以。这个引物是根据真菌漆酶保守氨基酸序列设计的，有文献用过的。大神，指点下啊
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3楼2013-04-26 09:53:28
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也碰到过，用文献上所给的通用引物，怎么都扩不出来，后来我用了高保真酶，竟然扩出来了，楼主不妨试一试。
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4楼2013-04-26 10:06:20
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