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yingrong147

铁虫 (初入文坛)


[交流] 原核表达 已有8人参与

我有一个大小1000bp左右的基因与pET-28a连接后导入到BL21中,按1:
50的比例接种至含卡那的50ml LB中,28℃,200rpm,2h,OD达到0.7,加入IPTG至终浓度分别为:0.1、0.5、1mM诱导,继续培养1、2、6、9h后取样进行SDS-PAGE。都没有表达,可能有哪些原因。会不会跟IPTG放太久有关?
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yingrong147

铁虫 (初入文坛)


引用回帖:
8楼: Originally posted by sunny-boy at 2013-04-23 23:10:47
我想先问你下。
在你链接转化好后,有没有再把构建好的工程菌提质粒,然后PCR,跑个电泳,看看你的目的片段是不是已经成功链接?

做了菌液PCR,也测序了是正确的
14楼2013-04-25 15:03:47
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流,期待你的精彩1 2013-04-23 20:43:21
载体的序列是否正确?跑的全菌总蛋白还是可溶蛋白?你指目标蛋白分子量附近没有诱导出特异条带吗?IPTG一般不会出什么问题,都是配好母液冻存在-20°C。
2楼2013-04-23 14:37:01
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yingrong147

铁虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-23 14:37:01
载体的序列是否正确?跑的全菌总蛋白还是可溶蛋白?你指目标蛋白分子量附近没有诱导出特异条带吗?IPTG一般不会出什么问题,都是配好母液冻存在-20°C。

序列是正确的,全菌总蛋白,没有特异条带。
3楼2013-04-23 15:35:02
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fuding6

木虫 (小有名气)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流,期待你的精彩1 2013-04-23 20:43:31
要证明是不是IPTG的问题就得做个阳性对照,如果IPTG没问题,那就换载体换宿主试试。
5楼2013-04-23 19:38:43
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