应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切、连接和转化
51/1返回列表
查看: 4198  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

374695805

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切、连接和转化

(1)双酶切( HindIII & NdeI )表达载体pET-28a(+)时，双酶切产物纯化后未经T4 Ligase连接居然还能转化成功,是什么原因？酶切体系如下(25微升)：酶切缓冲液(1*K):2.5; pET28a(+):20; HindIII酶液:1; NdeI:1; 无菌超纯水:0.5.
(2)载体自连的原理是什么？是载体经双酶切后剩余的部分连接还是双酶切中一个内切酶活性较低没有切开，切开的那端又重新连回原处？
(3)经单酶切的表达载体pET-28a(+)能转化至大肠杆菌体内吗？一定要是环状闭合共价的质粒(cccDNA)才能导入细胞吗？
(4)电转化前要对连接产物中的重组DNA进行洗涤沉淀，但连接产物体系为20微升，重组DNA无法用肉眼观察，如何在弃去上清的时候防止重组DNA也一并被弃去？
求各位高手指教！不甚感激！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

宝贝里

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-04-23 12:33:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 374695805 at 2013-04-25 13:29:07
(1)  是胶回收。有必要分布酶切提高酶切效率吗？
(2)  连接产物不纯化直接电转化，会打坏电转杯或者基因导入座的吧？如果是氯化钙转化是可以直接转化的，无需纯化。...

如果有通用buffer，一般不需要分步酶切，需要根据质粒的量使用适当的酶就可以了。连接产物实验室都是直接转化的，一般是2μl连接产物转化40μl感受态细胞。
赞一下 回复此楼
8楼2013-04-25 14:24:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-23 20:03:44
374695805: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-04-25 13:26:34
(1) 说明酶切不完全，有质粒没有切开，或者只切了一条链。你酶切后是切胶回收的吗？
(2) 是这么回事。
(3) 线状分子也可以转化大肠杆菌，只是转化效率要低很多。
(4) 电转化体系里盐会造成电弧，所以一般是用小于感受态细胞5%体积的连接产物不纯化直接转化的。
赞一下 回复此楼
3楼2013-04-23 14:45:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

panyuzhu

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2013-04-23 20:03:50
374695805: 金币+2 2013-04-25 13:29:29
本帖内容被屏蔽
4楼2013-04-23 16:50:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-04-24 20:24:27
酶切时，要注意DNA的量以及酶的用量。由于不同的酶的活性单位定义是不一样的，酶切时两种酶的用量通常也不一样。你的酶切体系中，用了20ul的DNA，你的质粒定量了（浓度知道吗？）？一般来说，一个简单的克隆，载体酶切时，用1---2ug的质粒就足够了，因为用回收的载体连接时，只需要50--100ng的酶切后的载体DNA就足够了。
太多的载体DNA可能导致质粒酶切不完全，就会出现你描述的情况1.
为了保证载体和PCR产物的完全酶切，我建议你用double digestion designer （http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php）来设计你的双酶切，可以精确计算酶切所需的酶量，还能根据酶的供应商来推荐最合适的buffer，确保酶切完全，有效减少克隆时的背景克隆，从而提高克隆成功率。
祝好运！
赞一下 回复此楼
5楼2013-04-23 22:07:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 8/400 2026-08-29 09:17 by G6APbkg8SA6w
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 基金不中，共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +4 gdd2018 2026-08-28 9/450 2026-08-28 14:22 by jklily
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭