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liuyan_54321新虫 (初入文坛)
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3个片段的重叠延伸pcr,pcr反应条件？
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| 最近我在做3个片段的重叠延伸pcr，对于3个片段的重叠延伸时的pcr反应条件应该怎么设置，还有我使用的是50ul的体系，模板量加多少比较好，期待各位高手的协助，谢谢 |
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gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2013-04-23 14:15:13
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刚做了10个片段的overlap pcr，非常顺利。 方法可参考Nat Protoc. 2006;1(2):791-7. PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences. 文章里用overlap pcr将小片段组装成较大的片段。 个人感觉片段割胶回收后，在体系里每个片段加20纳克就足够了。 片段之间的overlap至少要有20bp，在50-55度退火。 |
liuyan_543213楼2013-04-20 20:06:46
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| 三片段融合pcr，退火温度取决于外引物以及内引物重叠区Tm值，可以温度梯度优化，根据所用的DNA聚合酶扩增速度设定延伸时间，模板100-200ng，其中三片段摩尔比保持1:1:1，加入外引物，扩增30-35个循环 |
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2楼2013-04-20 17:12:28
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