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颜英

铜虫 (小有名气)

[求助] 荧光pcr阴性对照有扩增 已有2人参与

最近在做荧光pcr,阴性对照老是有扩增,刚开始以为是引物污染了,就用新的引物,结果还是有扩增;以为是水有问题,就用买的dd水,还是有扩增,这回就剩没换mix了,我这样排除对吗?为森马阴性对照会有扩增呢?
请各位大侠帮帮忙,跪谢啊
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by 颜英 at 2013-04-19 16:24:23
溶解曲线基本重合,做的是原核,沙门氏菌。。。我今天换了mix,还是有扩增,是不是枪的原因啊,我用84洗了枪,不知道会不会有效果。。。。...

你的负对照的模板是什么?RNA样品反转不加逆转录酶还是以水为模板?如果是前者,是样品里的基因组DNA没消化干净,如果是后者,说明体系有污染。
7楼2013-04-20 03:23:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zhangxingc: 金币+1, 欢迎常到微生物版 2013-04-19 08:44:11
扩增产物熔解曲线峰值与正常产物是否相同?做原核还是真核?引物是否跨内含子?做反转录前的RNA样品DNase消化是否完全?
2楼2013-04-19 05:46:29
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励积极回帖帮助解答问题 2013-04-24 08:58:15
应该先确定阴性对照里扩增出来的东西是不是和你的目标产物一样,及看看melt curve的出峰温度是不是一样,如果是一样的就是有污染,你有没有额外加Mg?此外操作要小心,可能你定量的基因很广谱,容易污染,可以到超净台里再试试。
3楼2013-04-19 12:33:09
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颜英

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-19 05:46:29
扩增产物熔解曲线峰值与正常产物是否相同?做原核还是真核?引物是否跨内含子?做反转录前的RNA样品DNase消化是否完全?

溶解曲线基本重合,做的是原核,沙门氏菌。。。我今天换了mix,还是有扩增,是不是枪的原因啊,我用84洗了枪,不知道会不会有效果。。。。
4楼2013-04-19 16:24:23
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