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zouchuwuyan

新虫 (初入文坛)

[求助] pet28a双酶切出现这种情况

pet28a双酶切以后出现这种情况，怎么回事？
1和2是用bamH1和xho1切的，3和4是用bamH1和Hind3切的，求解，谢谢大家。

图片2.png
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1楼 2013-03-31 23:12:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2013-04-02 21:04:31
引用回帖:
4楼: Originally posted by zouchuwuyan at 2013-04-01 09:22:52
是双酶切，1,2都是bamH1和xho1双酶切，3,4都是用bamH1和Hind3双酶切。切开之后反而跑的快了。...

酶切过后应该是线状分子，理论上大小应该有5点几kb，应该比超螺旋质粒跑得慢才对。但怎么说也不应该有很多条带。感觉你酶切时的质粒用量太大。你试过用单酶切线性化载体与没有酶切的质粒跑电泳比较条带大小吗？
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8楼2013-04-01 23:34:40
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zouchuwuyan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 18:13:20
感觉你的酶有问题，单酶切就出现那么多条带。检查一下质粒用量、酶的用量、buffer什么的。
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zouchuwuyan
2楼2013-04-01 00:31:35
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jjg0912

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 18:13:35
建议你去看看这个载体的酶切图谱，有这样的软件，你可以得到酶切后的片段，包括片段的数量以及大小。这样你以后做酶切实验就可以有的放矢了。
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3楼2013-04-01 06:22:17
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zouchuwuyan

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-01 00:31:35
感觉你的酶有问题，单酶切就出现那么多条带。检查一下质粒用量、酶的用量、buffer什么的。

是双酶切，1,2都是bamH1和xho1双酶切，3,4都是用bamH1和Hind3双酶切。切开之后反而跑的快了。
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4楼2013-04-01 09:22:52
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zouchuwuyan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jjg0912 at 2013-04-01 06:22:17
建议你去看看这个载体的酶切图谱，有这样的软件，你可以得到酶切后的片段，包括片段的数量以及大小。这样你以后做酶切实验就可以有的放矢了。

载体图谱我倒是看过，这几个酶切位点应该都是单一的，只是想不明白，为什么会出现这种情况。   老师，能否推荐个好上手的酶切图谱分析软件。
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5楼2013-04-01 09:30:05
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nemo88

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
6楼2013-04-01 10:03:59
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流，节日愉快 2013-04-01 16:08:50
本帖内容被屏蔽
7楼2013-04-01 10:07:54
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zouchuwuyan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by nemo88 at 2013-04-01 10:03:59
首先  十分确定是pET28a？ 不确定可以做个测序 用T7 引物测一个反应即可

我找到问题了，，发现用的两个酶不是同一个公司的，，都换成了Thermo的，就行了，谢谢了，很感激
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9楼2013-04-02 00:11:15
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zouchuwuyan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by nemo88 at 2013-04-01 10:07:54
如果确定是28a
那酶是否有问题  是否过期   操作过程中的条件是否会利于star活性的发生

分析酶切位点  可用primer， DNAMAN 等等软件
在线的NEB cutter也很好用 都可以显示出在整个序列中有几个同样的酶切位点 ...

我找到问题了，，发现用的两个酶不是同一个公司的，，都换成了Thermo的，就行了，谢谢了，很感激
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10楼2013-04-02 00:11:32
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