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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请问克隆表达时目的片段前多加了KOZAK序列会影响融合蛋白表达吗？
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djyqlzky

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问克隆表达时目的片段前多加了KOZAK序列会影响融合蛋白表达吗？

我想把一个基因克隆到含有FLAG标签的载体上，表达出带标签的融合蛋白，
但设计引物时在目的片段前多加了一段KOZAK序列GCCACC，听说KOZAK序列是
翻译起始位点，那么克隆上去后会影响融合蛋白表达吗？
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1楼 2013-03-30 23:48:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
djyqlzky(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 16:43:10
gyesang: 回帖置顶 2013-04-27 16:43:12
如果你在原核体系中表达蛋白，原核的翻译系统不识别KOZAK序列，所以应该不会影响融合蛋白的表达，但是在起始密码子前面应该有原核生物翻译所需的核糖体结合位点。如果你在真核体系里表达，最好有这个序列才能保证翻译效率。
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2楼2013-03-30 23:59:59
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zhangsmu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 很详细 2013-06-13 19:31:04
Kozak序列和IRES序列都可以行使翻译起始功能，但它们是有质的区别的。
Kozak序列是位于真核生物mRNA 5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是ACCACCATGG，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。对应于原核生物的SD序列。
IRES（（internal ribosome entry site）则是一些微小RNA病毒含有的能在真核细胞内模拟5’帽子结构行使翻译起始作用的特殊序列。
IRES序列常用于多顺反子基因表达。例如，在目的基因之后插入IRES序列，后面是选择标记基因，这样转录出来的mRNA就可以同时表达两种蛋白，选择标记基因翻译是通过不依赖于5’帽子的作用进行的.

注意最后一句话。

不知道你的问题是否解决了？
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3楼2013-05-14 10:42:46
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zhangsmu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-30 23:59:59
如果你在原核体系中表达蛋白，原核的翻译系统不识别KOZAK序列，所以应该不会影响融合蛋白的表达，但是在起始密码子前面应该有原核生物翻译所需的核糖体结合位点。如果你在真核体系里表达，最好有这个序列才能保证翻 ...

pCMV-eGFP-SV40载体里面eGFP ORF前面有KoZAK序列码？
感觉表达量还不错的哦。
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4楼2013-05-14 10:49:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 载体里预先都有序列的，确实不用担心 2013-06-13 19:43:52
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhangsmu at 2013-05-14 10:49:13
pCMV-eGFP-SV40载体里面eGFP ORF前面有KoZAK序列码？
感觉表达量还不错的哦。...

表达载体已经考虑到各种表达所需的元件，包括翻译起始的问题。一般只需要把目的基因插入到多克隆位点就可以做表达。我的意思是你没必要担心多余的几个核酸序列。
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5楼2013-05-14 12:23:18
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zhangsmu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-13 19:31:26
克隆上去后不会影响融合蛋白表达。
最好加上这个序列。ACCACC
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6楼2013-06-13 09:45:09
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