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肥猫p

木虫 (正式写手)

[交流] 大家同源重组时同源臂位于ORF之外的2端还是之外之内都行? 已有2人参与

大家通过同源重组敲除基因的时候,同源臂一般多大(真菌中or原核中),同源臂是位于ORF之外的2侧还是之外之内无所谓?
如果是做基因替换,就不能破坏上游的调控序列,因此最好的办法就是正好到起始密码子处,可是由于酶切位点、引物设计等问题,肯定不能这么完美。那么如果在原基因的ORF还残留几十个bp(3 的倍数),再接上新基因的oRF,可以这么干么?是否会不严谨?谢谢大家。欢迎大家讨论。
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
zhang8826857: 金币+2, 鼓励回帖 2013-03-29 09:39:20
zhang8826857: 金币+3, 鼓励回帖 2013-03-29 09:39:35
若是要用新基因完全替换原来的基因的话,当然是把两个同源臂设计在5'-起始密码子,终止密码子-3’。如果你只是要失活原来的基因,用抗性marker取代的话,只要缺失掉基因的一部分就可以了,同源臂的位置没必要那么固定。即使有残留的碱基,也不会形成正确的翻译产物。
2楼2013-03-28 23:57:48
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lcat

木虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
敲除的话无所谓,一般放在外侧更保险一些吧,这样把编码区完全置换掉。

如果要严格的“替换”,可以用融合PCR构建置换盒,不受酶切位点影响。参见http://www.sciencedirect.com/sci ... i/S1087184504001185
3楼2013-03-29 15:56:25
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