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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的基因连接表达载体的质粒PCR验证，结果出现2条带
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)

[交流] 目的基因连接表达载体的质粒PCR验证，结果出现2条带

目的基因连接表达载体的质粒PCR验证，结果出现2条带，其中一条和我的基因大小一致，还多了一条3000左右的条带，有哪位高手遇到过这样的问题？两次连接得到的质粒双酶切都没有得到我的目的基因大小一致的条带，同单酶切的条带是一样的。这种情况到底连没连上呢？
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1楼 2013-03-26 19:13:19
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hs19880208

新虫 (初入文坛)
★ ★
yuguiyan(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:58:03
1. 看看是不是你的引物浓度过高，出现了二聚体。2.看看你的酶切位点是不是合理。3.看看你的表达载体。
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2楼2013-03-26 19:19:00
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yuguiyan

至尊木虫 (文坛精英)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hs19880208 at 2013-03-26 19:19:00
1. 看看是不是你的引物浓度过高，出现了二聚体。2.看看你的酶切位点是不是合理。3.看看你的表达载体。

表达载体怎么看是不是好用啊？
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3楼2013-03-26 19:21:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:58:13
PCR结果有时候出现假阳性，用于快速检测。质粒酶切鉴定更准确，从双酶切和单酶切条带一样来看，我觉得你可能是没有连上。此外，单酶切出来的条带大小和载体单酶切是否相同？如果一样，就是空载体，目的片段没有连上。
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4楼2013-03-27 07:02:49
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fuding6

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
先送几个克隆测序再说
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5楼2013-03-27 09:37:37
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hs19880208

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引物同源性比较高。 PCR过程中酶切位点出现问题。
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6楼2013-03-27 15:21:47
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Francis_zw

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
结果很正常，有的质粒会开环，形成大的DNA片段。
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7楼2013-03-27 18:44:42
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心强我强

铜虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-27 07:02:49
PCR结果有时候出现假阳性，用于快速检测。质粒酶切鉴定更准确，从双酶切和单酶切条带一样来看，我觉得你可能是没有连上。此外，单酶切出来的条带大小和载体单酶切是否相同？如果一样，就是空载体，目的片段没有连上 ...

你好，想请教下单酶切出来的条带大小和载体单酶切是否相同？？什么意思，有什么区别？谢谢！
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8楼2013-03-27 19:58:38
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小科研女dow

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:58:25
若是有你的片段这是主要的
你可以将菌落先送去测序
如果测序结果正确
证明有你要的质粒
建议你可以将胶切下来再做一次PCR看是不是会有这样的情况
如果只是你要的结果 那这个就不重要了
还有就是 你可以再做一个试试
再换个载体不是首选是也可以啊
还有你的PCR条件可以用touchdown优话下
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9楼2013-03-27 20:53:58
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by 心强我强 at 2013-03-27 19:58:38
你好，想请教下单酶切出来的条带大小和载体单酶切是否相同？？什么意思，有什么区别？谢谢！...

克隆的质粒连上目的片段后会比载体分子量稍大，单酶切成线性后便于比较大小。
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10楼2013-03-27 22:47:52
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phoenix211

金虫 (小有名气)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-27 14:58:37
做PCR检测时，最好做一个阴性对照。。。扩出两三条带挺正常的，看看阴性对照会不会也扩出相同的非特异条带。
你应该将你的克隆酶切后跟空载体酶切后的产物一起跑胶比对下大小。
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11楼2013-03-28 11:16:26
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